万古霉素单用及联合利福平或磷霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌防耐药突变浓度的研究 被引量：33

1

作者 梅清 喻婷 +3 位作者 朱玉林 程君 叶英 李家斌 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期944-947,共4页

目的在体外探讨万古霉素单用及其分别与利福平、磷霉素联合使用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)防耐药突变浓度的影响,为防止细菌耐药的产生提供理论依据。方法应用肉汤法富集浓度为1010... 目的在体外探讨万古霉素单用及其分别与利福平、磷霉素联合使用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)防耐药突变浓度的影响,为防止细菌耐药的产生提供理论依据。方法应用肉汤法富集浓度为1010 CFU.ml-1细菌,琼脂平板倍比稀释法测定上述抗菌药物单用及联合使用对10株MRSA临床分离株的防耐药突变浓度,并计算相应的选择指数和耐药频率。结果万古霉素单用对上述10株MRSA的选择指数为16～64;分别与利福平、磷霉素联合使用选择指数下降为2～16和1～8,联合用药较单独用药选择指数下降2～32倍,其耐药频率也大幅下降。结论万古霉素分别与利福平、磷霉素联合使用均可降低其单用对MRSA的防耐药突变浓度,缩小耐药突变选择窗,防止耐药突变菌的产生。 展开更多

关键词 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 万古霉素 利福平 磷霉素 联合用药 防耐药突变浓度 耐药突变选择窗 耐药频率

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嗜麦芽窄食单胞菌的天然及获得性耐药机制研究进展 被引量：28

2

作者 胡立芬 叶英 +2 位作者 沈为华 李家斌 李旭 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期654-658,共5页

嗜麦芽窄食单胞菌,为条件致病菌,近年来感染率在不断增加。其不仅对多种抗生素存在天然耐药性,也可同过耐药基因水平转移获得对临床常见抗菌药物的耐药,本文综述了该菌对临床常见药物尤其是磺胺甲基异噁唑/甲氧苄啶的体外药敏情况,并阐... 嗜麦芽窄食单胞菌,为条件致病菌,近年来感染率在不断增加。其不仅对多种抗生素存在天然耐药性,也可同过耐药基因水平转移获得对临床常见抗菌药物的耐药,本文综述了该菌对临床常见药物尤其是磺胺甲基异噁唑/甲氧苄啶的体外药敏情况,并阐述耐药基因对抗菌药物耐药的作用。 展开更多

关键词 嗜麦芽窄食单胞菌 磺胺甲基异噁唑/甲氧苄啶 细菌耐药 耐药机制

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2008—2012年安徽省3154株非发酵菌分布特点及耐药分析 被引量：18

3

作者 周翔天 高丽萍 +4 位作者 夏粤华 梅清 刘艳艳 叶英 李家斌 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期301-305,315,共6页

目的了解安徽地区医院感染非发酵革兰阴性菌的分布特点及耐药状况,为临床抗感染治疗提供依据。方法抽取安徽省40家参加医院2008年至2012年,每年9月份临床分离的非发酵革兰阴性菌,采用国际标准琼脂糖平皿二倍稀释法进行体外药物敏感试验... 目的了解安徽地区医院感染非发酵革兰阴性菌的分布特点及耐药状况,为临床抗感染治疗提供依据。方法抽取安徽省40家参加医院2008年至2012年,每年9月份临床分离的非发酵革兰阴性菌,采用国际标准琼脂糖平皿二倍稀释法进行体外药物敏感试验,用最低抑菌浓度(MIC值)表示抗菌药物的抗菌活性,并按2012年美国临床和实验标准化研究所(CSLI)指导原则的标准计算细菌对抗菌药物的耐药率。使用WHONET5.6分析软件分析数据。结果共检测安徽省内3154株非发酵菌,占临床分离总数的27%。其中,占首位的是铜绿假单胞菌,其次为鲍曼不动杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌,分别占50.1%、36.8%和6.7%。非发酵菌感染部按检出率高低依次为:下呼吸道、伤口创面、泌尿生殖道、胸腹腔,上述4种标本占整个临床分离株的89.2%。病区分布主要为呼吸内科(48.7%),其次为重症监护室(20.2%)、烧伤科和神经内科分别占19.8%和14.3%。药敏结果显示,安徽地区非发酵菌对碳青霉烯类药物耐药率逐年升高,对头孢菌素类、青霉素类、喹诺酮类药物呈现高度耐药,并且多重耐药和泛耐药情况严重。结论近5年来,安徽地区非发酵菌的分离率较高,多重耐药现象严重,应重视非发酵菌的感染情况并做好对其的耐药性监测。 展开更多

关键词 非发酵菌 细菌耐药性监测 微生物敏感性试验 医院获得性感染 临床特征

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亚胺培南或美罗培南联合利福平降低不动杆菌防耐药突变浓度的体外研究 被引量：11

4

作者 马慧敏 胡立芬 +2 位作者 叶英 朱玉林 李家斌 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1690-1694,共5页

目的在体外探讨亚胺培南(IMP)和美罗培南(MER)单用及其分别与利福平(RFP)联用对不动杆菌的防耐药突变浓度(MPC)的影响,为防止细菌耐药的产生提供理论依据。方法采用琼脂二倍稀释法,测定IMP或MER与RFP在体外单独以及联合应用的最低抑菌浓... 目的在体外探讨亚胺培南(IMP)和美罗培南(MER)单用及其分别与利福平(RFP)联用对不动杆菌的防耐药突变浓度(MPC)的影响,为防止细菌耐药的产生提供理论依据。方法采用琼脂二倍稀释法,测定IMP或MER与RFP在体外单独以及联合应用的最低抑菌浓度(MIC)、计算部分抑菌浓度(FIC)指数。用肉汤法富集浓度为1010CFU/ml不动杆菌,采用琼脂平板二倍稀释法测定IMP和MER单药以及分别与RFP联用时对16株临床分离不动杆菌的MPC,并计算相应的选择指数(SI)。结果 IMP或MER分别与RFP联合应用后均以无关作用为主,未见拮抗作用,存在一定比例协同作用。IMP和MER单用对上述16株不动杆菌的SI均为16～128;分别与RFP联合使用SI均下降为1～32,联合用药较单独用药SI下降2～32倍。结论 IMP或MER分别与RFP联合使用均可降低其单用对不动杆菌的MPC,缩小MSW,防止耐药突变菌的产生。 展开更多

关键词 不动杆菌 防耐药突变浓度 耐药突变选择窗 亚胺培南 美罗培南 联合用药

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万古霉素联合用药降低对金黄色葡萄球菌防耐药突变浓度的研究 被引量：10

5

作者 喻婷 梅清 +3 位作者 朱玉林 程君 叶英 李家斌 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期859-863,共5页

目的体外研究万古霉素(vancomycin,VAN)分别与左氧氟沙星(levofloxacin,LVX)、利福平(rifampincin,RFP)、磷霉素(fosfomycin,FOM)联用对降低对金黄色葡萄球菌防耐药突变浓度(MPC)的比较,为指导临床联合应用抗菌药物,制定新的用药策略,... 目的体外研究万古霉素(vancomycin,VAN)分别与左氧氟沙星(levofloxacin,LVX)、利福平(rifampincin,RFP)、磷霉素(fosfomycin,FOM)联用对降低对金黄色葡萄球菌防耐药突变浓度(MPC)的比较,为指导临床联合应用抗菌药物,制定新的用药策略,防止细菌耐药产生提供理论依据。方法采用肉汤富集1010CFU/mL金黄色葡萄球菌ATCC29213,采用琼脂平板二倍稀释法测定单独用药的最低抑菌浓度(MIC),琼脂平板稀释法测定单独应用VAN以及与其他三种药物联用对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MPC。并计算出各药单独应用的MSW(MPC/MIC)。结果 VAN、LVX、RFP、FOM单药对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC分别为1,0.125,0.008和2μg/mL;MPC分别为64,2,>32,64μg/mL,MSW为64,6,>4000,32。联合用药后各药的MPC(μg/mL)降低程度如下:VAN+LVX(MPCNVA–4,MPCLVX–0.125),VAN+RFP(MPCNVA–4,MPCRFP–0.008),VAN+FOM(MPCNVA-1,MPCFOM-2)。联合LVX和RFP可使VAN的MPC降至原来的1/16倍,联合FOM可使VAN的MPC降至原来的1/64倍。结论 VAN与另三种药物联用,可以明显降低各自单独用药对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MPC,其中联合FOM降低其MPC幅度最大,缩小其MSW效果最好。 展开更多

关键词 万古霉素 联合用药 金黄色葡萄球菌:防耐药突变浓度 耐药突变选择窗

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2007—2009年安徽省痰标本中分离的革兰阴性菌耐药性监测 被引量：11

6

作者 费君 李家斌 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期948-951,共4页

目的分析2007—2009年安徽省临床分离痰标本中革兰阴性菌对抗菌药物耐药性变迁情况。方法采用2009年美国CLSI推荐的琼脂对倍稀释法进行抗菌药物敏感实验,计算抗菌药物的耐药率、敏感率和中介率,结果采用SPSS11.5软件进行统计分析。结果 ... 目的分析2007—2009年安徽省临床分离痰标本中革兰阴性菌对抗菌药物耐药性变迁情况。方法采用2009年美国CLSI推荐的琼脂对倍稀释法进行抗菌药物敏感实验,计算抗菌药物的耐药率、敏感率和中介率,结果采用SPSS11.5软件进行统计分析。结果 2007年1月至2009年12月从临床送检的痰标本中分离出革兰阴性菌1492株。来自ICU的不动杆菌对亚胺培南及美罗培南的敏感率分别为70.0%和61.3%,其对哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星和环丙沙星的耐药率均高于非ICU菌株。来自ICU与非ICU的铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、头孢他啶的敏感率均在50%以上。来自ICU的铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南和庆大霉素的耐药率均高于非ICU菌株。肺炎克雷伯菌对哌拉西林/三唑巴坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星的耐药率低于30%。大肠埃希菌对哌拉西林/三唑巴坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星的耐药率在30%以下,对氨苄西林、头孢曲松、氨曲南、庆大霉素、氟喹诺酮类的耐药率大于50%。结论定期进行耐药性监测有助于了解我省细菌耐药性变迁,为临床经验用药提供依据。 展开更多

关键词 不动杆菌 铜绿假单胞菌 肺炎克雷伯菌:大肠埃希菌 药物敏感试验 细菌耐药监测

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糖尿病合并细菌性肝脓肿患者的临床特点分析 被引量：2

7

作者 李旭峰 郑亚虹 +5 位作者 杨懿 杨宁 丁予婷 陆健娟 刘艳艳 李家斌 《中国感染控制杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期674-679,共6页

目的比较糖尿病(DM)合并肝脓肿(PLA)与非糖尿病(NDM)合并PLA患者之间的临床特征,以期为临床诊断及治疗提供依据。方法选取安徽医科大学某附属医院2002年7月—2022年2月收治的PLA患者,按照是否合并DM分为DM+PLA组和NDM+PLA组。回顾性分... 目的比较糖尿病(DM)合并肝脓肿(PLA)与非糖尿病(NDM)合并PLA患者之间的临床特征,以期为临床诊断及治疗提供依据。方法选取安徽医科大学某附属医院2002年7月—2022年2月收治的PLA患者,按照是否合并DM分为DM+PLA组和NDM+PLA组。回顾性分析两组患者的一般情况、临床表现和体征、并发症、生化和病原学检查结果、影像学表现、临床疗效及影响因素。结果共纳入PLA患者695例,其中DM+PLA组191例(27.5%),NDM+PLA组504例(72.5%)。DM+PLA组患者中男性、合并高血压的占比高于NDM+PLA组,而胆道疾病及恶性肿瘤占比低于NDM+PLA组(均P<0.05)。DM+PLA组患者出现发热,乏力,并发贫血、低蛋白血症的占比高于NDM+PLA组(均P<0.05)。与NDM+PLA组相比,DM+PLA组患者中性粒细胞计数、中性粒细胞百分比升高,而总蛋白、清蛋白含量及清蛋白/球蛋白比值均降低(均P<0.05)。DM+PLA组患者肺炎克雷伯菌检出、肝右叶脓肿发生的占比较NDM+PLA组更高(均P<0.05)。多因素logistic回归分析发现,恶性肿瘤是影响PLA患者临床疗效的危险因素,侵入性治疗是影响PLA患者临床疗效的保护因素,而血糖是影响NDM+PLA组患者临床疗效的危险因素。结论DM+PLA较NDM+PLA患者感染症状重,且伴有更高的肺炎克雷伯菌感染和肝右叶脓肿的比例。应加强对恶性肿瘤患者的关注,控制好血糖水平,必要时应及时辅以侵入性治疗手段。 展开更多

关键词 糖尿病 细菌性肝脓肿 临床特点 临床疗效 影响因素

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巨噬细胞Lamtor2基因敲除小鼠对肺炎克雷伯菌易感性的研究 被引量：4

8

作者 苏丛 伍婷 +5 位作者 徐方明 陈昊然 刘艳艳 律娜 兰燕虎 李家斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第4期505-509,共5页

目的通过建立Lamtor2巨噬细胞条件敲除小鼠感染肺炎克雷伯菌(Kp)模型,初步研究Lamtor2基因生物学功能及其在Kp感染过程中的相关机制。方法将引进的Lamtor2^(flox/+)小鼠自交,Lyz2-Cre小鼠与Lamtor2^(flox/+)进行杂交,获得基因型为Lamtor... 目的通过建立Lamtor2巨噬细胞条件敲除小鼠感染肺炎克雷伯菌(Kp)模型,初步研究Lamtor2基因生物学功能及其在Kp感染过程中的相关机制。方法将引进的Lamtor2^(flox/+)小鼠自交,Lyz2-Cre小鼠与Lamtor2^(flox/+)进行杂交,获得基因型为Lamtor2^(flox/flox)Lyz2-Cre^(-/-)和Lamtor2^(flox/+)Lyz2-Cre^(+/-)的子代小鼠;将上述两种基因型子代小鼠进行杂交,得到对照组小鼠(Lamtor2^(flox/flox)Lyz2-Cre^(-/-))和Lamtor2条件性基因敲除小鼠(Lamtor2^(flox/floxLyz)2-Cre^(+/-))。提取小鼠脚趾基因组DNA,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代小鼠基因型并提取肺泡巨噬细胞,利用qRT-PCR和Western blot验证Lamtor2基因敲除效果。小鼠感染Kp,观察生存状况;体外采用RT-qPCR检测Kp感染肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和Cxcl1表达水平,两组间比较采用t检验;Western blot验证iNOS的表达水平。结果成功建立Lamtor2条件性基因敲除小鼠模型,子代存活且可育;与对照组小鼠比较,实验组小鼠在感染Kp后生存率降低;Lamtor2^(flox/flox)Lyz2-Cre^(+/-)小鼠来源的肺泡巨噬细胞中的TNF-α(t=17.54,P=0.0032)、IL-1β(t=15.37,P=0.0042)和Cxcl1(t=37.82,P=0.0007)表达水平降低,且iNOS表达下降。结论构建了Lamtor2条件性基因敲除小鼠,感染肺炎克雷伯菌后,小鼠的生存率下降;肺泡巨噬细胞iNOS表达降低。 展开更多

关键词 Lamtor2 条件性基因敲除 繁育 肺炎克雷伯菌

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Nod2基因在肺炎克雷伯菌肝脓肿中的作用研究

9

作者 孟宝 伍婷 +5 位作者 苏丛 孙雅婷 唐明洋 郭明娟 兰燕虎 李家斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第9期1380-1384,共5页

目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染Nod2基因肝组织条件敲除小鼠模型,初步探究Nod2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓肿过程中的作用及机制。方法将引进的Nod2^(flox/+)小鼠自交获得Nod2^(flox/flox)小鼠,同时将Alb-Cre^(+)小鼠与Nod... 目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染Nod2基因肝组织条件敲除小鼠模型,初步探究Nod2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓肿过程中的作用及机制。方法将引进的Nod2^(flox/+)小鼠自交获得Nod2^(flox/flox)小鼠,同时将Alb-Cre^(+)小鼠与Nod2^(flox/+)进行杂交获得Nod2^(flox/+);Alb-Cre^(+)的子代小鼠;将上述两种基因型的子代小鼠进行杂交,获得Nod2基因肝脏条件性敲除小鼠(Nod2^(flox/flox);Alb-Cre^(+))和同窝阴性对照组小鼠(Nod2^(flox/flox))。提取小鼠脚趾基因组DNA,经PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定子代小鼠基因型并提取小鼠肝脏,利用RT-qPCR和Western blot验证Nod2基因在肝脏中的敲除效果。实验组和对照组小鼠分别感染K.pneumoniae,观察不同时间点小鼠生存率及肝组织病理变化;利用RT-qPCR检测实验组和对照组小鼠感染K.pneumoniae 48 h后肝组织内肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和趋化因子CXC配体1(CXCL1)的mRNA的表达水平。结果Nod2^(flox/flox);Alb-Cre^(+)小鼠肝脏NOD2 mRNA表达量降低(P<0.05),Western blot结果显示NOD2蛋白表达量降低;与对照组小鼠比较,实验组小鼠在感染K.pneumoniae后生存率降低(中位生存时间60.5 h,P=0.0469),肝组织出现了更为严重的病理损伤;实验组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和CXCL1的mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NOD2在K.pneumoniae感染诱导肝脓肿的过程中起保护作用。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌肝脓肿 NOD2基因 炎症反应 保护作用

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p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

10

作者 张春 苏丛 +1 位作者 伍婷 朱立雨 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期398-402,共5页

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10... 目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。 展开更多

关键词 P62 慢病毒载体构建 三质粒包装系统 THP-1细胞 肺炎克雷伯菌 过表达

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肺炎克雷伯菌肝脓肿小鼠模型的制备与评价 被引量：2

11

作者 郑亚虹 岳程程 +4 位作者 张慧 贺玲玲 戴媛媛 刘艳艳 李家斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第11期1701-1706,共6页

目的构建稳定且可靠的肺炎克雷伯菌肝脓肿(KPLA)小鼠模型,为该疾病的后续研究提供依据。方法选择肺炎克雷伯菌(KP)临床分离菌株181608为实验菌株,将不同浓度的细菌悬液通过腹腔注射,利用改良寇式法计算半数致死量(LD50),以1/2的LD50浓... 目的构建稳定且可靠的肺炎克雷伯菌肝脓肿(KPLA)小鼠模型,为该疾病的后续研究提供依据。方法选择肺炎克雷伯菌(KP)临床分离菌株181608为实验菌株,将不同浓度的细菌悬液通过腹腔注射,利用改良寇式法计算半数致死量(LD50),以1/2的LD50浓度注射C57BL/6J小鼠。通过小鼠一般情况、体质量变化、白细胞计数、HE染色以及肝脏菌落计数等指标综合评价该模型。结果根据改良寇式法计算出KP在C57BL/6J小鼠中的LD50约为104 CFU/ml。小鼠感染细菌24 h取肝脏脓肿部位的细菌培养结果为阳性,通过菌落形态、拉丝试验阳性和质谱结果鉴定致病菌为KP。HE染色结果提示小鼠感染后肝脏出现大面积坏死以及炎性细胞的大量浸润。随着感染时间的延长,小鼠精神状况变差,加之进食量的减少,体质量逐渐降低。检测造模小鼠的白细胞数高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。除此之外,谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和炎症因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-5和肿瘤坏死因子(TNF)-α]在肝脓肿组明显升高,且RT-qPCR结果也显示炎性和趋化因子[IL-1β、IL-6、IL-10和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1]的mRNA水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过腹腔注射成功建立KPLA小鼠感染模型,为肝脓肿的研究提供稳定和易复制的动物模型。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌 肝脓肿 动物模型

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基于CRISPR-Cas9技术构建gpr41基因敲除的RAW264.7细胞系 被引量：3

12

作者 苏丛 徐方明 +6 位作者 伍婷 张鹏飞 陈昊然 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 律娜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第5期800-803,共4页

采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质... 采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建G-蛋白偶联受体41(gpr41)基因敲除的RAW264.7细胞系。利用慢病毒转染,构建稳定表达Cas9蛋白的巨噬细胞株。针对gpr41基因作用的功能区域,设计靶向gpr41基因的向导RNA(gRNA),构建pLenticrisprV2重组质粒转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子测序验证gRNA的有效性。鉴定成功的pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒采用转染试剂转染巨噬细胞系RAW264.7。筛选阳性单克隆细胞株,Western blot检测gpr41基因的表达。测序结果证实pLenticrisprV2-gpr41-gRNA重组质粒构建成功;Western blot筛选出重组质粒pLenticrisprV2-gpr41-gRNA3转染RAW264.7细胞13号单克隆株的GPR41蛋白不表达。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了gpr41基因敲除的巨噬细胞株,为研究gpr41基因在RAW264.7细胞中的作用机制奠定基础。 展开更多

关键词 CRISPR-Cas9技术 gpr41 巨噬细胞 基因敲除

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CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞的GPR43基因抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能 被引量：1

13

作者 徐方明 苏丛 +5 位作者 伍婷 陈昊然 张鹏飞 刘艳艳 兰燕虎 李家斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期481-486,共6页

目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sg... 目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43^-/-RAW264.7细胞),Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43^-/-RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后,RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43^-/-RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43^-/-RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。 展开更多

关键词 RAW264.7细胞 成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9) G蛋白偶联受体43(GPR43) 肺炎克雷伯

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晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2)基因缺失加重肺炎克雷伯菌引起的小鼠脓毒症

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作者 朱立雨 张春 +3 位作者 葛小花 孟宝 伍婷 李家斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期481-486,共6页

目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染肝组织晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2)基因条件敲除小鼠模型,初步探究LAMTOR2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓毒症过程中的作用及机制。方法繁育获得肝脏LAMTOR2基因条件性敲除小鼠(LAMTOR2^... 目的建立肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染肝组织晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2)基因条件敲除小鼠模型,初步探究LAMTOR2基因在K.pneumoniae感染引起肝脓毒症过程中的作用及机制。方法繁育获得肝脏LAMTOR2基因条件性敲除小鼠(LAMTOR2^(flox/flox);Alb⁃Cre^(+))和同窝阴性对照组小鼠(LAMTOR2^(flox/flox))。提取实验组和对照组小鼠的肝组织,利用实时荧光定量PCR和Western blot法检测LAMTOR2的mRNA和蛋白表达水平确定LAMTOR2在肝组织的敲除效果。实验组和对照组小鼠分别感染K.pneumoniae,观察24、36、48、72 h的小鼠生存率,HE染色观察肝组织病变情况;利用实时荧光定量PCR检测实验组和对照组小鼠感染K.pneumoniae 24 h后肝组织肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)、白细胞介素1β(IL⁃1β)和CXC趋化因子配体1(CXCL1)的mRNA的表达水平。结果成功获得肝组织LAMTOR2基因条件性敲除小鼠;与对照组小鼠相比,实验组小鼠在感染K.pneumoniae后生存率降低,肝组织出现更严重损伤;实验组小鼠肝组织TNF⁃α、IL⁃1β和CXCL1的mRNA表达水平显著降低,小鼠免疫应答能力降低。结论LAMTOR2在K.pneumoniae感染诱导脓毒症的过程中起保护作用。 展开更多

关键词 肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae) 肝脓毒症 晚期内体/溶酶体适配蛋白2(LAMTOR2) 炎症反应

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