G蛋白偶联受体107的缺失对HaCaT细胞生物学行为的影响 被引量：1

1

作者 汪璟 赵韦 +3 位作者 徐德苹 廖开楠 臧丹丹 周海胜 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第3期385-391,共7页

目的构建稳定敲除G蛋白偶联受体107(GPR107)基因的人类角质形成细胞系(HaCaT),并初步探究GPR107的缺失对HaCaT细胞生物学行为的影响。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建敲除GPR107基因的HaCaT细胞,并通过有限稀释法获得GPR107缺失... 目的构建稳定敲除G蛋白偶联受体107(GPR107)基因的人类角质形成细胞系(HaCaT),并初步探究GPR107的缺失对HaCaT细胞生物学行为的影响。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建敲除GPR107基因的HaCaT细胞,并通过有限稀释法获得GPR107缺失的单克隆细胞;利用Western blot和PCR扩增基因组DNA并测序验证验证敲除GPR107的单细胞克隆。运用流式细胞分析术检测细胞周期变化;利用CCK-8检测细胞增殖;运用流式细胞术检测细胞凋亡水平;运用Western blot检测细胞分化标记分子的变化;运用细胞划痕实验等方法分析细胞迁移能力。结果成功将LentiCas9-Blast与plenti-guide-RNA-GPR107质粒转染进HaCaT细胞,并通过有限稀释法得到了21株单克隆细胞,Western blot显示其中8株细胞GPR107表达显著降低;进一步采用细胞基因组PCR测序,显示获得了C4与2D82株GPR107-/-HaCaT单克隆细胞株。CCK-8检测、流式细胞术检测显示GPR107基因缺失导致HaCaT细胞出现G0G1期阻滞,增殖能力显著减弱,凋亡水平增加;Western blot显示敲除GPR107后HaCaT细胞分化加快;细胞划痕实验结果表明敲除GPR107后HaCaT细胞迁移能力增强。结论成功构建GPR107基因缺失的HaCaT细胞株;GPR107缺失阻滞HaCaT细胞G0G1期从而抑制了HaCaT细胞增殖并促进细胞凋亡,敲除GPR107后HaCaT细胞分化能力与迁移能力均增强。 展开更多

关键词 G蛋白偶联受体107 人类角质形成细胞 CRISPR/Cas9 细胞增殖 细胞周期

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氨氯地平通过抑制足细胞的Ca^(2+)内流促进细胞自噬

2

作者 赵韦 徐德苹 +3 位作者 廖开楠 蔡春林 臧丹丹 周海胜 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第7期1179-1186,共8页

目的探究降血压药物氨氯地平对足细胞内Ca^(2+)内流及其自噬的影响。方法体外常规培养永生化的人足细胞(HPC),使用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)以及L型Ca^(2+)阻断剂氨氯地平单独或者联合处理HPC细胞,Ca^(2+)成像系统实时检测药物处理后HPC细胞... 目的探究降血压药物氨氯地平对足细胞内Ca^(2+)内流及其自噬的影响。方法体外常规培养永生化的人足细胞(HPC),使用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)以及L型Ca^(2+)阻断剂氨氯地平单独或者联合处理HPC细胞,Ca^(2+)成像系统实时检测药物处理后HPC细胞内Ca^(2+)通量的瞬时变化;Western blot法检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值变化、Beclin-1、P62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平;流式细胞术检测488 nm处Fluo-4AM的阳性细胞数以分析HPC细胞内Ca^(2+)内流水平;Lyso-Tracker Green活细胞染色分析溶酶体荧光强度;流式细胞术检测HPC细胞凋亡率。结果与对照组比较,AngⅡ组Ca^(2+)瞬时通量和Fluo-4AM阳性细胞数显著增加(P<0.001)、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值(P<0.001)和Beclin-1的蛋白表达(P<0.01)均降低、P62的表达升高(P<0.01)、溶酶体荧光强度减弱(P<0.05)、细胞凋亡率升高(P<0.0001)、凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低(P<0.01)、Bax蛋白升高(P<0.001)。与对照组比较,氨氯地平组Fluo-4AM阳性细胞数显著降低(P<0.001)、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值(P<0.001)和Beclin-1的蛋白表达(P<0.001)均升高、P62蛋白表达降低(P<0.05)、溶酶体荧光强度增强(P<0.01)、细胞凋亡率降低(P<0.01)、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.001)、Bax蛋白降低(P<0.001)。与AngⅡ组比较,AngⅡ+氨氯地平组Fluo-4AM阳性细胞数显著降低(P<0.001)、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值(P<0.01)以及Beclin-1的蛋白表达升高(P<0.05)、P62蛋白降低(P<0.01)、溶酶体荧光强度增加(P<0.05)、细胞凋亡率降低(P<0.001)、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.001)、Bax蛋白表达降低(P<0.001)。结论氨氯地平抑制足细胞内Ca^(2+)内流,促进足细胞自噬、抑制凋亡,对于预防高血压肾病发生具有一定的作用。 展开更多

关键词 足细胞 氨氯地平 血管紧张素Ⅱ 自噬 CA^(2+) 细胞凋亡

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LSS功能缺失对NAFLD模型小鼠肠道功能的影响

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作者 白红枚 杨振 +9 位作者 胡韦康 王子涵 周文静 何清雅 钟健 李名聪 刘莉 张朝阳 张素梅 张胜权 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第9期1653-1660,共8页

目的探究羊毛固醇合成酶(LSS)基因功能缺失后对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型小鼠肠道功能的影响。方法利用CRISPR/Cas9系统建立LSS全身杂合敲除C57小鼠(LSS+/-)模型,用60%脂肪比的高脂饲料喂养6个月后,通过HE和油红O染... 目的探究羊毛固醇合成酶(LSS)基因功能缺失后对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型小鼠肠道功能的影响。方法利用CRISPR/Cas9系统建立LSS全身杂合敲除C57小鼠(LSS+/-)模型,用60%脂肪比的高脂饲料喂养6个月后,通过HE和油红O染色检测肝脏组织内脂肪沉积情况;HE染色观察小肠组织的形态变化;试剂盒检测肠道组织中总胆固醇含量的变化;苯酚红糊体检测小鼠的胃肠动力功能;Evans blue染色检测肠道通透性;Western blot检测LSS、紧密连接蛋白(Claudin)-1、Claudin-5、白细胞分化抗原36(CD36)、尼曼-匹克C1型类似蛋白1(NPC1L1)蛋白在小肠组织中的表达情况。结果肝脏HE和油红O染色结果显示在高脂饮食组中LSS基因敲低小鼠的肝脏脂肪沉积低于野生型小鼠,LSS基因杂合敲除小鼠肠道组织中的总胆固醇含量降低(P<0.01),但肠组织HE染色未观察到两组小鼠之间存在形态差异,LSS基因杂合敲除小鼠的胃肠动力功能也未出现显著变化,Evans blue检测肠道通透性结果显示LSS基因杂合敲除在高脂饮食小鼠的肠道通透性降低(P<0.05),Claudin-5蛋白在LSS基因杂合敲除高脂饮食小鼠的肠道组织中表达量升高(P<0.05),而LSS蛋白在LSS杂合敲除小鼠肠道组织中表达量降低(P<0.05)。结论在高脂饮食诱导的NAFLD模型中,LSS基因杂合敲除后通过调节肠道组织内胆固醇的代谢和上调Claudin-5的表达,减轻了高脂饮食诱导的肝脏脂肪沉积并改善了肠道的屏障功能。 展开更多

关键词 羊毛固醇合成酶 胆固醇代谢 非酒精性脂肪肝病 肠道通透性 紧密连接蛋白 肠道屏障功能

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不同年龄段C57BL/6J雌性小鼠的行为及空间记忆变化

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作者 杨振 白红枚 +8 位作者 胡韦康 李名聪 江小丽 张朝阳 王子涵 周文静 何清雅 钟健 张胜权 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第8期1410-1417,共8页

目的探究不同年龄段(青年、中年、老年)C57BL/6J雌性小鼠行为和空间记忆的变化。方法C57BL/6J雌性小鼠根据年龄进行分组,分为雌性青年(YG)组、雌性中年(MG)组、雌性老年(OG)组。Morris水迷宫实验测定空间记忆能力,旷场和高架十字迷宫实... 目的探究不同年龄段(青年、中年、老年)C57BL/6J雌性小鼠行为和空间记忆的变化。方法C57BL/6J雌性小鼠根据年龄进行分组,分为雌性青年(YG)组、雌性中年(MG)组、雌性老年(OG)组。Morris水迷宫实验测定空间记忆能力,旷场和高架十字迷宫实验观察活动水平和焦虑程度。Western blot测定各组雌鼠脑组织海马区CREB、CaMKⅡ(pan)和CaMKⅡ(p)蛋白表达。结果相较于YG组小鼠,MG组和OG组小鼠体质量均增加(P<0.01,P<0.001)。相较于OG组小鼠,YG组和MG组小鼠第3象限逃避潜伏期、穿越次数均缩短,但差异无统计学意义。与OG组小鼠相比,YG组小鼠旷场内的运动速度增加,差异有统计学意义(P<0.01),MG组小鼠旷场内的运动速度差异无统计学意义,MG组小鼠进入中央区次数增加,差异有统计学意义(P<0.05),YG组小鼠进入中央区次数差异无统计学意义。与OG组小鼠相比,YG组小鼠高架十字迷宫内运动速度增加,差异有统计学意义(P<0.05),MG组小鼠高架十字迷宫内运动速度差异无统计学意义,YG组、MG组小鼠闭臂进入次数均增加,差异有统计学意义(P<0.001,P<0.01)。与YG组小鼠相比,OG组小鼠CaMKⅡ(pan)相对表达水平上升,差异有统计学意义(P<0.05),MG组小鼠CaMKⅡ(pan)相对表达水平差异无统计学意义。结论随着年龄增加,C57BL/6J雌鼠体质量逐渐增加,活动水平和探索欲望逐渐降低,空间记忆能力也在不断衰退,同时焦虑水平和焦虑样行为增加。 展开更多

关键词 C57BL/6J小鼠 雌鼠 空间记忆 焦虑 CaMKII(p) 行为学

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胶束莪术醇对卵巢癌相关巨噬细胞极化的影响 被引量：3

5

作者 唐勤 王晶 +4 位作者 陈冰 汪生 张敏敏 张梦媛 吴强 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第5期840-846,共7页

目的探讨纳米材料胶束莪术醇(MC)通过促进卵巢癌腹水M2型巨噬细胞向M1型极化调控卵巢癌免疫微环境的机制。方法(1)小鼠分组后,用鼠卵巢癌细胞株ID8构建卵巢癌腹水模型,观察体质量变化,收集肿瘤组织和腹水。流式细胞术检测肿瘤组织和腹... 目的探讨纳米材料胶束莪术醇(MC)通过促进卵巢癌腹水M2型巨噬细胞向M1型极化调控卵巢癌免疫微环境的机制。方法(1)小鼠分组后,用鼠卵巢癌细胞株ID8构建卵巢癌腹水模型,观察体质量变化,收集肿瘤组织和腹水。流式细胞术检测肿瘤组织和腹水巨噬细胞CD86和CD206表达;Western blot法检测蛋白激酶B(PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达。(2)诱导人单核细胞白血病(THP-1)细胞转化M2型巨噬细胞(THP-1 M2φ),用10μg/ml的MC处理,流式法检测凋亡率;qRT-PCR法检测巨噬细胞甘露糖受体(CD206)、转化生长因子-β(TGF-β)和白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达;流式法检测CD86和CD206表达;Western blot法检测Akt/mTOR表达。结果(1)体内实验:给药后,MC组鼠平均体质量低于对照组;MC组肿瘤组织和腹水巨噬细胞CD206表达降低,CD86表达上调;MC组腹水Akt、mTOR磷酸化水平降低。(2)体外实验:用药前后THP-1 M2φ凋亡无差异;MC组CD206、TGF-β的mRNA表达及CD206蛋白表达明显低于对照组,同时IL-1β、TNF-α的mRNA和CD86蛋白表达明显高于对照组;MC组Akt、mTOR的磷酸化水平降低。结论MC促进腹水巨噬细胞向M1极化调控卵巢癌免疫微环境,其机制可能与Akt/mTOR通路有关。 展开更多

关键词 卵巢癌 免疫微环境 巨噬细胞 MC AKT/MTOR

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尿酸盐在慢性肾病并发肾间质纤维化中的作用及机制 被引量：4

6

作者 杨萍 徐德苹 +3 位作者 童子文 陈琼 徐如月 周海胜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第7期1206-1212,共7页

目的探讨尿酸盐在慢性肾病并发肾间质纤维化过程中的作用及机制。方法利用0.2%腺嘌呤的饲料喂养小鼠9周,构建慢性肾病小鼠模型。造模结束后,小鼠眼眶后静脉丛采血,检测肾功能和血尿酸含量;HE染色和PAS染色分析肾脏组织病理变化;Masson... 目的探讨尿酸盐在慢性肾病并发肾间质纤维化过程中的作用及机制。方法利用0.2%腺嘌呤的饲料喂养小鼠9周,构建慢性肾病小鼠模型。造模结束后,小鼠眼眶后静脉丛采血,检测肾功能和血尿酸含量;HE染色和PAS染色分析肾脏组织病理变化;Masson染色观察肾脏纤维化程度;尿酸盐染色观察肾组织中尿酸盐沉积;Western blot和免疫组化检测目标分子的表达变化。利用不同浓度尿酸刺激原代培养小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)及人肾小管上皮细胞系(HKC);划痕实验观察尿酸对细胞迁移的影响。结果动物水平上,生化分析检测结果显示,模型组小鼠血清尿素氮(P=0.0064)、肌酐(P=0.0080)、血尿酸(P=0.0007)水平较对照组明显增加;HE和PAS染色结果显示,模型组小鼠出现严重肾小管损伤及炎症细胞浸润;Masson染色结果显示,模型组胶原沉积明显增加;尿酸盐染色结果显示,与对照组比较,模型组小鼠肾组织出现大量尿酸盐结晶;Western blot和免疫组化结果显示,模型组小鼠波形蛋白、平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1(TGF-β1)水平较对照组升高,E钙黏蛋白水平较对照组降低。细胞水平上,划痕结果显示,尿酸刺激促进肾小管上皮细胞迁移;Western blot检测结果与免疫组化一致。结论尿酸可通过促进肾小管上皮细胞分泌TGF-β1,进而促进上皮-间质细胞转分化,加速肾间质纤维化的发生。 展开更多

关键词 尿酸盐 高尿酸血症 慢性肾病 肾间质纤维化 上皮-间质细胞转分化

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GPR108缺失对脂多糖诱发脓毒症小鼠的炎症反应 被引量：1

7

作者 张银涛 杨萍 +3 位作者 臧丹丹 涂珍珍 徐如月 周海胜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第11期1896-1902,共7页

目的探究G蛋白偶联受体108(GPR108)的缺失对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠所产生全身性炎症反应的影响。方法雄性C57BL/6小鼠和GPR108基因敲除鼠随机分为4组:WT组、WT-LPS组、KO组、KO-LPS组。观察不同组小鼠的生理特征,肝脏、肺组织的... 目的探究G蛋白偶联受体108(GPR108)的缺失对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠所产生全身性炎症反应的影响。方法雄性C57BL/6小鼠和GPR108基因敲除鼠随机分为4组:WT组、WT-LPS组、KO组、KO-LPS组。观察不同组小鼠的生理特征,肝脏、肺组织的形态变化。提取骨髓来源的巨噬细胞流式检测其M1极化情况,同时检测其肝脏、肺组织、巨噬细胞及血清的白细胞介素-6(IL-6)的表达水平。结果KO-LPS组小鼠肝脏、肺组织损伤表现明显,KO-LPS组小鼠较WT-LPS组小鼠骨髓源性巨噬细胞向M1极化的数量明显多;同时,KO-LPS组小鼠在组织水平、细胞水平、血清水平检测IL-6的表达均明显高于WT-LPS组小鼠(P<0.05)。结论在LPS诱导的脓毒症小鼠全身性炎症感染时,GPR108缺失加重全身炎症反应。GPR108对LPS诱导的脓毒症小鼠的炎症反应具有抑制作用。 展开更多

关键词 脓毒症 G蛋白偶联受体108 巨噬细胞 脂多糖 白细胞介素-6

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新型R型噬菌体尾样细菌素对MRSA的抗菌活性研究

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作者 唐伟 刘颖 +6 位作者 唐震海 唐颖 李昕 姚杰 李维祖 徐元宏 周强 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1760-1765,共6页

目的探索阴沟肠杆菌SHAMU191747所分泌的新型R型噬菌体尾样细菌素(phage tail-like bacteriocin,PTLB)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的抗菌活性。方法琼脂平板拮抗试验和肉汤微量发酵... 目的探索阴沟肠杆菌SHAMU191747所分泌的新型R型噬菌体尾样细菌素(phage tail-like bacteriocin,PTLB)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的抗菌活性。方法琼脂平板拮抗试验和肉汤微量发酵试验,检测阴沟肠杆菌SHAMU191747对MRSA的拮抗活性。超高速离心法和密度梯度离心法,制备阴沟肠杆菌SHAMU191747发酵上清液粗提物。使用透射电镜检测粗提物中有无新型R型PTLB。琼脂平板点种法,验证粗提物对MRSA的抗菌活性。采用SDS-PAGE电泳检测新型R型PTLB的分子量。结果阴沟肠杆菌SHAMU191747分泌新型R型PTLB,对MRSA具有强拮抗效应。新型R型PTLB的分子量约35 ku,能够高效杀伤MRSA;尾鞘未收缩的功能性分子的物理尺寸为(142.7±4.3)×(13.8±0.6)nm,尾鞘收缩的非功能性分子的物理尺寸为(57.7±1.2)×(20.8±1.5)nm。结论阴沟肠杆菌SHAMU191747产生的新型R型PTLB能够高效杀伤MRSA,具有开发成新型抗菌药物的潜力,临床应用前景很大。 展开更多

关键词 阴沟肠杆菌 细菌素 噬菌体尾样细菌素 金黄色葡萄球菌 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 抗菌活性

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佐剂性关节炎大鼠肾功能损伤及对肾脏有机阴离子转运体3表达的影响

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作者 李孟阳 汪乾镭 +1 位作者 魏伟 王春 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第9期1495-1500,共6页

目的研究佐剂性关节炎(AA)对大鼠肾脏功能和肾脏有机阴离子转运体3(OAT3)表达的影响。方法在大鼠右侧后足趾皮内注射弗氏完全佐剂建立AA模型。固定时间点收集大鼠血液和尿液,观察肾损伤指标的动态变化。通过肾脏的HE染色切片观察肾损伤... 目的研究佐剂性关节炎(AA)对大鼠肾脏功能和肾脏有机阴离子转运体3(OAT3)表达的影响。方法在大鼠右侧后足趾皮内注射弗氏完全佐剂建立AA模型。固定时间点收集大鼠血液和尿液,观察肾损伤指标的动态变化。通过肾脏的HE染色切片观察肾损伤情况。免疫组化和Western blot检测肾皮质OAT3蛋白和炎性因子白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。结果与正常组相比,AA大鼠关节炎指数评分、继发性足爪肿胀、关节肿胀数、全身评分均显著增加(P<0.05)。X线检测结果显示,AA模型大鼠足爪骨关节出现软组织水肿以及骨畸形的特征。生化指标显示,AA大鼠的肾损伤指标出现明显异常。免疫组化与Western blot结果显示,AA大鼠肾皮质OAT3的表达水平显著降低,同时炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平明显升高(P<0.05)。结论AA大鼠的肾功能损伤可能与肾脏OAT3的表达降低及炎性因子表达升高有关。 展开更多

关键词 佐剂性关节炎 肾损伤 大鼠 肾皮质 有机阴离子转运体3 炎性因子

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基于柱前衍生化-GC-MS技术探究不同采摘期青钱柳叶挥发性物质组成

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作者 汪安 程桂林 +2 位作者 苏敏 查萍萍 汪生 《安徽农业科学》 CAS 2024年第17期189-193,共5页

[目的]采用GC-MS技术,解析青钱柳叶中的挥发性物质组成,探究13批次不同采摘期青钱柳叶中挥发性物质含量差异。[方法]用甲醇超声、甲醇加热回流、乙醇超声、乙醇加热回流、乙酸乙酯超声和正己烷超声6种提取方法,分别对青钱柳叶的挥发性... [目的]采用GC-MS技术,解析青钱柳叶中的挥发性物质组成,探究13批次不同采摘期青钱柳叶中挥发性物质含量差异。[方法]用甲醇超声、甲醇加热回流、乙醇超声、乙醇加热回流、乙酸乙酯超声和正己烷超声6种提取方法,分别对青钱柳叶的挥发性成分进行提取,再结合BSTFA衍生法,综合探究青钱柳叶的挥发性成分组成;研究2023年4月15日—11月1日13个不同采摘期样品中的挥发性物质含量差异。[结果]乙酸乙酯提取-BSTFA衍生化法能更全面探究青钱柳叶中挥发性物质的组成,研究共鉴定出25种物质,青钱柳叶中挥发性物质主要是亚麻酸、棕榈酸、呋喃果糖、丙三醇、叶绿醇和硬脂酸等,脂肪酸总含量约为50%,还包括小分子有机酸、醇类和单糖类物质等。S1~S9和S10~S13批次样本物质的含量存在一定的差异。[结论]春夏季采摘的青钱柳叶不饱和脂肪酸含量较高,秋季单糖类物质含量明显增高。 展开更多

关键词 青钱柳叶 挥发性物质 采摘期 柱前衍生化-GC-MS

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IL-10调控HaCaT细胞增殖及分化的分子机制 被引量：2

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作者 尹雪莉 贾波 +7 位作者 刘莉 李明聪 张军 杨振 白红枚 胡伟康 张素梅 张胜权 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第6期890-895,共6页

目的探讨白细胞介素10(IL-10)对皮肤角质形成细胞(HaCaT)增殖影响和对氯化钙(CaCl 2)诱导的角质形成细胞分化标志物的表达影响及其可能的分子机制。方法以不同浓度IL-10(0、3、10、30 ng/ml)处理HaCaT细胞不同时间(0、24、48、72 h),MT... 目的探讨白细胞介素10(IL-10)对皮肤角质形成细胞(HaCaT)增殖影响和对氯化钙(CaCl 2)诱导的角质形成细胞分化标志物的表达影响及其可能的分子机制。方法以不同浓度IL-10(0、3、10、30 ng/ml)处理HaCaT细胞不同时间(0、24、48、72 h),MTS分析细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期;IL-10(终浓度为10 ng/ml)预处理HaCaT 1 h,加入或不加CaCl 2(终浓度为1.2 mmol/L)培养24、48、72 h,Western blot检测IL-10对HaCaT分化标志物表达影响;丝裂原蛋白激活激酶-胞外信号调节激酶(MAPKs-ERK1/2)特异性抑制剂PD98059及磷脂酰肌醇激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K-AKT)特异性抑制剂LY294002预处理HaCaT细胞,分别提取细胞总RNA和蛋白,荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测IL-10对HaCaT细胞分化标志物(Keratin1、Keratin5、Involucrin)表达影响。结果MTS结果显示,在72 h内,IL-10(30 ng/ml和较低浓度)对HaCaT细胞增殖无影响;流式细胞分析结果提示IL-10不影响HaCaT细胞周期进程。Western blot分析显示,IL-10上调HaCaT角质形成细胞角质细胞分化标志物Involucrin表达,而对Keratin1及Keratin5没有显著的影响。机制研究分析显示,IL-10能够活化ERK1/2和AKT,增加其磷酸化水平;RT-qPCR和Western blot结果显示PD98059及LY294002部分阻断IL-10诱导的Involucrin的表达。结论IL-10在一定浓度范围内不影响HaCaT的增殖;IL-10部分通过MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT途径上调HaCaT分化标志物Involucrin表达。 展开更多

关键词 HACAT细胞 细胞增殖 IL-10 分化标志物 信号途径

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β-DG过表达对结肠癌细胞系SW620细胞凋亡的影响

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作者 钱成 徐涛 潘林鑫 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第10期1491-1496,共6页

目的研究β-肌营养不良蛋白聚糖(β-DG)在HT29、HCT116、SW480、SW620等4种常见的结肠癌细胞系中的表达情况,及其过表达后对SW620结肠癌细胞凋亡及相关蛋白表达变化的影响。方法培养结肠癌细胞系,提取总蛋白进行免疫印迹,检测各细胞中... 目的研究β-肌营养不良蛋白聚糖(β-DG)在HT29、HCT116、SW480、SW620等4种常见的结肠癌细胞系中的表达情况,及其过表达后对SW620结肠癌细胞凋亡及相关蛋白表达变化的影响。方法培养结肠癌细胞系,提取总蛋白进行免疫印迹,检测各细胞中内源性β-DG蛋白的表达情况;构建pcDGFP-β-DG真核表达质粒,瞬时转染至SW620细胞中,提取总蛋白进行免疫印迹或直接进行免疫荧光制片,检测β-DG的过表达和细胞定位情况;过表达β-DG后,利用流式细胞术检测SW620细胞凋亡的变化情况,并进一步检测细胞凋亡标志蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)的表达变化情况。结果与人胚肾上皮细胞(HEK 293T)相比,结肠癌细胞系中内源性β-DG(43 ku)的表达量均有所降低,以SW620细胞下降更为明显,且都检测到了不同表达程度的β-DG水解片段(31 ku)。成功构建pcDGFP-β-DG真核表达质粒,在SW620细胞中能够有效表达,且主要定位在细胞质中靠近核膜的位置。过表达β-DG后,SW620细胞的凋亡率为0.167±0.014,高于空白组(0.075±0.027)和对照组(0.084±0.023),差异有统计学意义(P<0.05),且过表达β-DG后,完整型PARP(113 ku)的蛋白含量有所降低,而裂解型PARP(89 ku)的蛋白含量有所增高。结论β-DG在结肠癌细胞系中异常表达,主要表现在其异常的水解断裂。过表达β-DG能够促进SW620细胞凋亡及相关凋亡蛋白的表达,为进一步了解β-DG功能,及其与结肠癌之间的关系提供了细胞学基础。 展开更多

关键词 结肠癌 β-肌营养不良蛋白聚糖 过表达 细胞凋亡

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Sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化 被引量：3

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作者 童子文 徐德苹 +4 位作者 王喆 杨萍 涂珍珍 臧丹丹 周海胜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第5期724-730,共7页

目的研究Sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病(CKD)并发肾间质纤维化(RIF)中的作用和机制。方法利用PCR鉴定正常基因型(Sigirr^(+/+))小鼠和Sigirr基因缺失(Sigirr^(-/-))小鼠。含0.2%高腺嘌呤饲料喂养小鼠,连续喂养12周,以建立慢性肾脏损伤并... 目的研究Sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病(CKD)并发肾间质纤维化(RIF)中的作用和机制。方法利用PCR鉴定正常基因型(Sigirr^(+/+))小鼠和Sigirr基因缺失(Sigirr^(-/-))小鼠。含0.2%高腺嘌呤饲料喂养小鼠,连续喂养12周,以建立慢性肾脏损伤并发RIF模型。收集小鼠眼框静脉血以检测肾功能;利用HE染色分析肾脏组织病理变化,通过Masson染色观察肾脏纤维化程度,利用IHC和Western blot检测白细胞介素(IL)-1β、MyD88和NF-κB等信号分子变化,同时观察转化生长因子(TGF)-β1、E-cadherin和Vimentin的表达变化。结果肾功能检测结果显示高腺嘌呤喂养小鼠的血清肌酐和尿素氮较对照组增加;HE和Masson染色结果显示:与Sigirr^(+/+)小鼠比较,Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中,炎症细胞浸润和胶原纤维沉积更明显。IHC和Western blot结果显示IL-1β及其下游的MyD88表达增加,p-P65水平显著增加;Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中IL-1β、MyD88、p-P65等变化较Sigirr^(+/+)小鼠显著;同时TGF-β1显著增加,且Vimentin的表达增加,E-cadherin的表达明显降低,Western blot检测Vimentin、E-cadherin结果与免疫组化一致,且α-SMA也显著升高。结论高腺嘌呤饮食可以建立CKD并发RIF小鼠模型。Sigirr的缺失增加肾间质IL-1β介导NF-κB信号通路的活化,促进TGF-β1表达,有利于上皮-间质细胞转分化相关RIF过程。 展开更多

关键词 Sigirr基因 慢性肾病 肾间质纤维化 IL-1Β NF-ΚB

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紫檀芪减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤的机制 被引量：2

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作者 姚雷 蔡海建 +3 位作者 刘邓 陈立建 唐震海 都建 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期310-314,共5页

目的探索天然的酚类化合物紫檀芪(pterostilbene,PTE)减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤的机制。方法40只C57小鼠分为对照组、模型组、治疗组建立70%肝脏缺血/再灌注(缺血60 min)模型,并通过灌注和消化法分离原代肝窦内皮细胞(liver sinusoi... 目的探索天然的酚类化合物紫檀芪(pterostilbene,PTE)减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤的机制。方法40只C57小鼠分为对照组、模型组、治疗组建立70%肝脏缺血/再灌注(缺血60 min)模型,并通过灌注和消化法分离原代肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)。通过HE染色观察肝脏结构;透射电镜(TEM)观察肝窦内皮细胞超微结构;扫描电镜(SEM)观察LSECs窗孔的结构;Western blot检测LSECs内血红素氧化酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)表达水平。结果HE染色显示,PTE能够改善肝脏缺血性损伤;TEM观察到PTE对肝窦内皮细胞具有保护作用;扫描电镜观察发现,空白对照组LSECs窗孔数量较多,模型组窗孔数量减少;与模型组比较,治疗组LSECs窗孔数量有所增加。Western blot结果显示,PTE能够诱导LSECs中HO-1表达。结论PTE通过诱导血红素氧化酶-1表达减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤,保护肝脏免受缺血/再灌注损伤。 展开更多

关键词 紫檀芪 缺血/再灌注 肝窦内皮细胞 窗孔 扫描电镜 血红素加氧酶1

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跨膜蛋白173对TGF-β1活化的肝星状细胞增殖与凋亡的影响及机制研究 被引量：2

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作者 潘林鑫 李玉 +1 位作者 徐涛 钱成 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1435-1443,共9页

目的观察跨膜蛋白173(TMEM173)的表达变化对TGF-β1诱导活化的人肝星状细胞(LX-2)增殖和凋亡的影响及其机制。方法TGF-β1诱导建立LX-2细胞活化模型,分别利用MTT、EdU和FCM技术检测TMEM173的表达变化对活化LX-2细胞增殖和凋亡的影响,并... 目的观察跨膜蛋白173(TMEM173)的表达变化对TGF-β1诱导活化的人肝星状细胞(LX-2)增殖和凋亡的影响及其机制。方法TGF-β1诱导建立LX-2细胞活化模型,分别利用MTT、EdU和FCM技术检测TMEM173的表达变化对活化LX-2细胞增殖和凋亡的影响,并进一步利用WB技术检测其对细胞增殖和凋亡相关通路蛋白表达的影响。结果TGF-β1成功诱导LX-2细胞活化,且与对照组相比,GFP-TMEM173组细胞的增殖率明显升高、且凋亡率明显降低,而TMEM173-siRNA组细胞的结果则相反;另外,与对照组相比,GFP-TMEM173组细胞中PCNA和Bcl-2的蛋白表达水平明显上调,且Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达水平明显下调,而TMEM173-siRNA组细胞的结果则相反。结论TMEM173对活化LX-2细胞的增殖和凋亡具有调控功能,即其过表达能够促进LX-2细胞增殖和抑制细胞凋亡,反之则抑制LX-2细胞增殖和促进细胞凋亡,表明TMEM173可能在肝星状细胞增殖与活化过程中扮演着积极的角色,是肝纤维化基因治疗的潜在靶点。 展开更多

关键词 跨膜蛋白173 转化生长因子Β1 活化 肝星状细胞 细胞增殖 细胞凋亡

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人G蛋白偶联受体107表达载体构建及细胞定位的研究 被引量：1

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作者 冯阳 贺凡 +3 位作者 涂珍珍 臧丹丹 倪鸣岳 周海胜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第7期1012-1015,共4页

目的克隆人G蛋白偶联受体107(GPR107)基因以构建真核表达载体,并探讨GPR107在真核细胞中的亚细胞定位。方法通过分子克隆技术克隆人GPR107基因的cDNA;利用真核细胞表达载体pCMV-Tag2B构建重组载体pCMV-Tag2B-GPR107,瞬时转染至293T细胞,... 目的克隆人G蛋白偶联受体107(GPR107)基因以构建真核表达载体,并探讨GPR107在真核细胞中的亚细胞定位。方法通过分子克隆技术克隆人GPR107基因的cDNA;利用真核细胞表达载体pCMV-Tag2B构建重组载体pCMV-Tag2B-GPR107,瞬时转染至293T细胞,Western blot检测GPR107的表达变化;采用免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察GPR107在细胞中的定位。结果经过基因测序证实获得人GPR107的cDNA;成功构建真核表达载体pCMV-Tag2B-GPR107;Western blot结果显示,与未转染组比较,转染组GPR107表达量明显上调。激光共聚焦显微镜观察显示GPR107主要表达于细胞质。结论GPR107在293T细胞中过表达,并定位于细胞质。 展开更多

关键词 GPR107 表达 转染 亚细胞定位

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基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究 被引量：1

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作者 王雯雯 涂珍珍 +3 位作者 臧丹丹 汪璟 张银涛 周海胜 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第4期528-533,共6页

目的建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法根据人GPR108基因序列设计,合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRN... 目的建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法根据人GPR108基因序列设计,合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列,构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP+细胞于96孔培养板中,培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108-/-和GPR108+/+的THP-1细胞,Western blot法检测细胞内白细胞介素-8(IL-8)的表达,流式微球技术(CBA)检测细胞培养上清液中的IL-8浓度。结果成功构建重组慢病毒载体pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA,转染THP-1细胞后通过流式细胞仪分选获得单细胞克隆F9。PCR和Western blot法均证实F9是GPR108-/-THP-1单细胞克隆。LPS刺激GPR108-/-和GPR108+/+THP-1细胞,Western blot和CBA的结果均显示敲除GPR108的THP-1细胞中IL-8的合成和分泌明显减少。结论成功建立GPR108缺失的THP-1细胞株;缺失GPR108的THP-1细胞在受到LPS刺激时产生的趋化因子IL-8显著降低。为后续研究GPR108在免疫炎症中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 GPR108 THP-1细胞 CRISPR/Cas9 IL-8

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基于双五氟苄基硫醚的气相色谱-质谱法测定大鼠脑组织中的H_(2)S 被引量：2

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作者 王秀 汪生 陈志武 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期1114-1120,共7页

目的通过气相色谱-质谱(GC-MS)法测定硫化氢(H_(2)S)的衍生化产物双五氟苄基硫醚(bispentafluorobenzyl sulfide,C_(6)F_(5)CH_(2)SCH_(2)C_(6)F_(5)),建立大鼠脑组织中H_(2)S的测定方法。方法色谱条件:HP-5MS(30 m×250μm×0... 目的通过气相色谱-质谱(GC-MS)法测定硫化氢(H_(2)S)的衍生化产物双五氟苄基硫醚(bispentafluorobenzyl sulfide,C_(6)F_(5)CH_(2)SCH_(2)C_(6)F_(5)),建立大鼠脑组织中H_(2)S的测定方法。方法色谱条件:HP-5MS(30 m×250μm×0.25μm)色谱柱,色谱柱程序升温,进样口温度280℃。质谱条件:20 eV电子轰击离子源,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,接口温度280℃。采用多反应检测扫描(MRM)模式,对C_(6)F_(5)CH_(2)SCH_(2)C_(6)F_(5)的离子对(m/z 394→181,m/z 181→161)进行定量、定性分析。结果脑组织样本中硫氢化钠(NaHS)在0.25~256μmol·L^(-1)范围内具有良好的线性关系,检测限为0.1μmol·L^(-1)。日内、日间精密度均小于15%,无明显的基质效应,回收率在90%以上。可选择性测定脑组织中的H_(2)S,测得大鼠脑皮质组织中基础H_(2)S浓度为(11.84±0.38)μmol·L^(-1),静脉注射NaHS后,脑组织中H_(2)S浓度呈剂量依赖性增高。结论C_(6)F_(5)CH_(2)SCH_(2)C_(6)F_(5)的GC-MS法是测定大鼠脑组织中H_(2)S的一种可靠、有效的方法,H_(2)S可透过血脑屏障进入脑组织。 展开更多

关键词 硫化氢 气相色谱-质谱法 脑组织 双五氟苄基硫醚 衍生化 血脑屏障

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RB1-C磷酸化位点突变体与Sedlin的共定位研究 被引量：1

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作者 潘林鑫 徐涛 +1 位作者 范礼斌 钱成 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第6期839-844,共6页

目的研究人视网膜母细胞瘤蛋白1羧基端(RB1-C)磷酸化位点突变体的蛋白表达和细胞定位情况及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)共定位的变化情况。方法设计RB1-C磷酸化位点突变体的引物,以质粒pcDNA3.1-FLAG-RB1-C为模板,利用PC... 目的研究人视网膜母细胞瘤蛋白1羧基端(RB1-C)磷酸化位点突变体的蛋白表达和细胞定位情况及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)共定位的变化情况。方法设计RB1-C磷酸化位点突变体的引物,以质粒pcDNA3.1-FLAG-RB1-C为模板,利用PCR技术分别扩增出pcDNA3.1-FLAG-RB1-C-S788A、S795A、S807A、T811A、T821A、T826A共6个突变体,并对各位点进行测序。分别将以上突变体单独转染至HEK 293T、COS7细胞中,利用Western blot和免疫荧光(IF)技术观察其蛋白表达和细胞定位情况;分别将以上突变体及Sedlin共同转染至COS7细胞中,利用IF技术观察二者在细胞内的共定位情况,并与野生型RB1-C的结果进行比较分析。结果测序结果显示RB1-C的6个磷酸化位点均突变成功,并能够在真核细胞内正常表达,且与野生型RB1-C的细胞定位基本一致,即主要定位在细胞核内。与野生型RB1-C相比,RB1-C-S788A、S795A、T821A、T826A与Sedlin的共定位未发生改变,即主要共定位在细胞核内;但RB1-C-S807A、T811A与Sedlin的共定位发生了显著变化,除了共定位于细胞核外,在细胞质中也存在共定位现象。结论RB1-C磷酸化位点突变体成功构建并表达,其中S807A、T811A两个磷酸化位点的突变能够显著改变RB1-C与Sedlin在细胞中共定位区域,表明它们是RB1-C和Sedlin结合的关键位点之一,为进一步研究RB1-C和Sedlin的相互作用奠定了基础。 展开更多

关键词 视网膜母细胞瘤蛋白1 磷酸化 迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白 共定位

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转录因子GRHL3调控GPR108基因表达及其作用机制 被引量：1

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作者 倪鸣岳 刘源立 +3 位作者 涂珍珍 郭立钰 臧丹丹 周海胜 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第3期446-455,共10页

目的研究转录因子果蝇头状因子(grainyhead-like,GRHL)3调控G蛋白偶联受体108(G protein-coupled receptor 108,GPR108)表达的分子机制。方法利用生物信息学分析在各种癌症组织的肿瘤细胞中,GRHL3和GPR108的表达水平以及相互关系;运用... 目的研究转录因子果蝇头状因子(grainyhead-like,GRHL)3调控G蛋白偶联受体108(G protein-coupled receptor 108,GPR108)表达的分子机制。方法利用生物信息学分析在各种癌症组织的肿瘤细胞中,GRHL3和GPR108的表达水平以及相互关系;运用反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测GRHL3和GPR108基因在人皮肤鳞癌细胞系(A-431)、人肝癌细胞系(Hep G2)以及人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)的表达;采用分子克隆技术构建含有GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子的荧光素酶报告基因表达载体;通过双荧光素酶报告基因检测系统,观察GRHL3对GPR108基因启动子的调控作用;通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)分析GRHL3和GPR108启动子结合位点之间的关系。结果生物信息学分析在各种组织的肿瘤细胞中,GRHL3的表达较低,而GPR108的表达较高。利用分子克隆技术成功构建了GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子荧光素酶报告基因表达载体;GRHL3对荧光素酶报告基因GPR108的启动子具有明显的抑制作用。将GPR108启动子上的结合位点删除突变后,GRHL3对GPR108基因启动子的负调控作用减弱;ChIP结果显示GRHL3能与GPR108启动子结合位点结合。结论转录因子GRHL3通过结合GPR108启动子上的保守序列5′-AACCGGTG-3′抑制GPR108表达。 展开更多

关键词 果蝇头状因子3 G蛋白偶联受体108 启动子

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