自噬参与神经细胞中过表达tau和异常磷酸化tau蛋白的降解 被引量：19

1

作者 冯利杰 张瑾 +4 位作者 丁倩 朱娜 王鹏 沈玉君 沈玉先 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期356-362,共7页

目的观察自噬对神经细胞内源性tau、过表达tau和异常磷酸化tau蛋白水平的影响,探讨不同形式tau蛋白降解的可能机制。方法体外培养小鼠神经瘤母细胞株N2a和敲除Atg5基因的小鼠胚胎成纤维细胞株MEF,分别转染GFP-tau质粒,并用蛋白磷酸酯酶... 目的观察自噬对神经细胞内源性tau、过表达tau和异常磷酸化tau蛋白水平的影响,探讨不同形式tau蛋白降解的可能机制。方法体外培养小鼠神经瘤母细胞株N2a和敲除Atg5基因的小鼠胚胎成纤维细胞株MEF,分别转染GFP-tau质粒,并用蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)诱导tau蛋白过度磷酸化,自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)和溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)处理细胞,Western blot法检测tau、磷酸化tau以及自噬相关蛋白LC3和p62的表达;放线菌酮(cycloheximide,CHX)示踪法观察tau和磷酸化tau的降解;GFP-tau和RFP-Lamp1质粒共转染N2a细胞,观察tau和溶酶体的定位;免疫荧光染色和DAB染色观察自噬抑制对表达tau细胞形态的影响。结果与溶媒对照组相比,NH4Cl和rapamycin处理组细胞内源性tau蛋白水平无明显变化;过表达tau的细胞中,NH4Cl能增加tau和OA诱导的磷酸化tau蛋白水平,而rapamycin处理组细胞中tau和磷酸化tau水平降低,尤其是高分子量的磷酸化tau寡聚体明显减少;CHX实验证明自噬抑制能减缓tau和磷酸化tau的降解;tau和溶酶体在细胞内存在共定位;过表达tau的N2a细胞经NH4Cl处理后,胞质中出现大量tau聚集体,细胞核变小、固缩甚至消失。结论自噬参与神经细胞中过表达tau和异常磷酸化tau蛋白的降解,抑制自噬能增加tau的细胞毒作用。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 TAU 磷酸化 自噬 蛋白降解 细胞毒性

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MANF对神经细胞中tau蛋白过度磷酸化的抑制作用 被引量：5

2

作者 李静 王涛 +2 位作者 沈玉君 方圣云 沈玉先 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1111-1115,共5页

目的观察MANF是否可以抑制冈田酸诱导的N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化,以了解MANF神经保护作用的机制。方法采用体外培养小鼠神经母瘤细胞株N2a,以冈田酸(okadaic aicd,OA)作为诱导剂诱导N2a细胞中tau蛋白过度磷酸化,在加入重组人MANF... 目的观察MANF是否可以抑制冈田酸诱导的N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化,以了解MANF神经保护作用的机制。方法采用体外培养小鼠神经母瘤细胞株N2a,以冈田酸(okadaic aicd,OA)作为诱导剂诱导N2a细胞中tau蛋白过度磷酸化,在加入重组人MANF蛋白干预或转染MANF过表达质粒及siRNA后,用MTT法检测细胞增殖活性的变化,并用AT-8抗体检测tau蛋白ser202/Thr205位点的磷酸化水平变化。结果 N2a细胞在加入重组人MANF蛋白预处理4 h后加入OA诱导24 h后,经Western blot和MTT法检测发现,重组人MANF蛋白能明显抑制N2a细胞中tau蛋白的过度磷酸化,并可促进N2a细胞的增殖活性;在转染MANF过表达质粒后,N2a细胞中OA诱导的过度磷酸化tau蛋白减少,且细胞活性增加;与此相反,转染siRNA下调内源性的MANF的表达则能促进N2a细胞中的tau蛋白过度磷酸化,并抑制细胞活性。结论 MANF可以抑制神经细胞中tau蛋白过度磷酸化,这可能是其发挥神经保护作用的原因之一。 展开更多

关键词 MANF TAU 冈田酸 阿尔采末病 神经保护 细胞活性

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MANF对内质网应激诱导的细胞凋亡的保护作用 被引量：5

3

作者 陈滢 李成锦 +6 位作者 杨文 程里 安然 都建 沈玉君 冯利杰 沈玉先 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2013年第11期1308-1312,共5页

目的构建中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)基因真核表达质粒并转染小鼠神经瘤细胞系(N2A),建立稳定表达MANF的细胞系,并观察MANF对内质网(ER)应激诱导细胞凋亡的影响。方法将MANF基因克隆至pEGFP-C2载体中,经酶切、聚合酶链式反... 目的构建中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)基因真核表达质粒并转染小鼠神经瘤细胞系(N2A),建立稳定表达MANF的细胞系,并观察MANF对内质网(ER)应激诱导细胞凋亡的影响。方法将MANF基因克隆至pEGFP-C2载体中,经酶切、聚合酶链式反应(PCR)、测序检测其构建的正确性,脂质体转染法将重组质粒转染入N2A细胞,经G418(500μg/ml)连续筛选,获得稳定表达MANF的神经细胞系。细胞免疫荧光法观察MANF的定位,蛋白质印迹法(Western blot)和反转录PCR法(RT-PCR)鉴定稳转细胞系中MANF的蛋白和基因表达水平。在稳定转染细胞系中,分别用4μg/ml衣霉素(TM)处理16 h和10μmol/Lβ淀粉样蛋白(Aβ)处理24 h诱导ER应激,Western blot法检测CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达和Caspase-3的激活情况。结果构建的pEGFP-C2-MANF质粒经酶切测序等鉴定确定构建成功,经G418抗性筛选出稳定转染MANF的N2A细胞系,RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光法证明稳转细胞中MANF的基因和蛋白水平均高表达,并且MANF的细胞定位准确。诱导ER应激后,MANF能显著抑制CHOP的表达和Caspase-3的激活。结论成功建立稳定表达MANF的神经细胞系,并且发现MANF可以抑制ER应激诱导的神经细胞凋亡。 展开更多

关键词 中脑星形胶质细胞源性神经营养因子 转染 内质 网应激 神经保护

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自噬降低异常磷酸化tau蛋白所致的神经细胞毒性 被引量：3

4

作者 丁倩 张瑾 +3 位作者 马钰泱 沈玉君 沈玉先 冯利杰 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期761-767,共7页

目的观察雷帕霉素和饥饿诱导的自噬对表达异常磷酸化tau蛋白的神经细胞形态、tau蛋白聚集和磷酸化tau降解的影响,探讨这两种经典的诱导自噬方式抑制磷酸化tau的细胞毒性,发挥细胞保护作用的可能机制。方法体外培养小鼠神经瘤母细胞株N2... 目的观察雷帕霉素和饥饿诱导的自噬对表达异常磷酸化tau蛋白的神经细胞形态、tau蛋白聚集和磷酸化tau降解的影响,探讨这两种经典的诱导自噬方式抑制磷酸化tau的细胞毒性,发挥细胞保护作用的可能机制。方法体外培养小鼠神经瘤母细胞株N2a并转染tau真核表达质粒,蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)诱导tau蛋白异常磷酸化,雷帕霉素(rapamycin,Rapa)或Earle's平衡盐溶液(Earle's balanced salts,EBSS)诱导细胞自噬,巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf A1)抑制自噬,DAB染色观察表达tau细胞的形态变化;激光共聚焦显微镜观察细胞内tau聚集体;TUNEL染色和caspase-3活性检测细胞凋亡;免疫印迹(immunoblot,IB)检测磷酸化tau和细胞自噬水平。结果过表达tau的细胞胞体变圆,突起减少;OA处理后细胞突起进一步减少甚至消失,胞质出现明显tau聚集体,凋亡细胞增加,剪切型caspase-3水平上调;Rapa和EBSS处理后的细胞形态均有一定程度改善,tau聚集体明显减少,细胞凋亡减少,剪切型caspase-3表达降低;而自噬抑制剂Baf A1处理的细胞变圆,皱缩,胞质大量tau聚集体,凋亡细胞明显增加。IB结果显示Rapa明显降低高分子量的磷酸化tau,而EBSS能明显减少低分子量磷酸化tau的水平。结论 Rapa和EBSS诱导的细胞自噬均能抑制磷酸化tau蛋白的细胞毒作用,但其发挥细胞保护作用的机制不同,Rapa诱导自噬倾向于降解磷酸化tau的寡聚体,而EBSS更易于降解低分子量的磷酸化tau蛋白。 展开更多

关键词 TAU 磷酸化 雷帕霉素 自噬 蛋白降解 细胞毒性

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异丙酚预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时自噬的影响 被引量：4

5

作者 汤为香 沈玉君 +1 位作者 李元海 沈玉先 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2017年第12期1819-1822,共4页

目的评价异丙酚预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时自噬的影响。方法健康成年雄性SD大鼠50只,体重240~280 g,采用随机数字表法,将SD大鼠随机分为5组(n=10):假手术组(S组);异丙酚单独给药组(P组):经股静脉以12 mg/(kg·h)持续泵注1%... 目的评价异丙酚预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤时自噬的影响。方法健康成年雄性SD大鼠50只,体重240~280 g,采用随机数字表法,将SD大鼠随机分为5组(n=10):假手术组(S组);异丙酚单独给药组(P组):经股静脉以12 mg/(kg·h)持续泵注1%异丙酚45 min;肝脏缺血再灌注组(HIR组):血管夹钳夹支配肝左叶、中叶的肝蒂,造成70%肝脏缺血,1 h后放开血管夹恢复血供造成缺血再灌注损伤;异丙酚预处理组(PHIR组):于缺血前30 min经股静脉泵注异丙酚12 mg/(kg·h)30 min至缺血15 min;脂肪乳预处理组(IHIR组):于缺血前30 min经股静脉泵注脂肪乳1.2 ml/(kg·h)30 min至缺血15 min。于再灌注6 h时,处死大鼠取腹主动脉血测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性,取肝左叶肝脏采用Western blot法检测自噬标志物LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及Beclin-1的表达水平。结果电镜显示,S组细胞结构正常,未见自噬体,而HIR组可见大量自噬体及自噬溶酶体,PHIR组细胞结构基本正常,少见自噬体;与S组相比,HIR组肝细胞电镜下见大量富含血清ALT和AST活性增高,肝组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达上调(P<0.05),P组各项指标差异无统计学意义;与HIR组相比,PHIR组血清ALT和AST活性显著降低,肝组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达显著下调(P<0.05),而IHIR组各项指标差异无统计学意义。结论异丙酚预处理减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤机制可能与抑制肝细胞自噬激活有关。 展开更多

关键词 异丙酚 肝脏 缺血再灌注损伤 自噬

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α1抗胰蛋白酶突变体ATZ过表达增强细胞自噬水平 被引量：1

6

作者 朱娜 冯利杰 +2 位作者 王海萍 沈玉君 沈玉先 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期921-925,共5页

目的观察α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)Z型突变体(α1-antitrypsin Z variant,ATZ)表达对细胞自噬水平的影响,探讨ATZ细胞毒作用的可能机制。方法体外培养人胚肾细胞株HEK 293T并转染ATZ真核表达质粒,利用Western blot法检测自噬... 目的观察α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)Z型突变体(α1-antitrypsin Z variant,ATZ)表达对细胞自噬水平的影响,探讨ATZ细胞毒作用的可能机制。方法体外培养人胚肾细胞株HEK 293T并转染ATZ真核表达质粒,利用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达,免疫荧光染色观察LC3的细胞定位,real-time PCR法检测自噬相关基因Atg5、Atg12和Beclin1的变化,DAB染色观察ATZ过表达对细胞形态的影响。结果与转染空质粒对照组相比,ATZ过表达促进细胞自噬的标志分子LC3由LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ,p62水平降低;而经自噬抑制剂氯化铵处理后,ATZ过表达细胞中出现LC3点状聚集,p62水平增加;同时,ATZ过表达明显增加自噬相关基因Atg5、Atg12的mRNA水平,而对Beclin1无明显影响;少量表达ATZ的细胞形态基本正常,细胞中LC3形成点状聚集;反之,过度表达ATZ的细胞核变小、固缩甚至消失,无LC3-Ⅱ表达。结论过表达ATZ通过增加Atg5和Atg12表达激活自噬,这可能与其细胞毒性有一定相关性。 展开更多

关键词 α1 抗胰蛋白酶 Z 型突变体 自噬 P62 LC3 Bec-lin1 细胞毒性

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GFP-ATZ在HEK 293T中的表达及其细胞毒作用 被引量：1

7

作者 王海萍 王法财 沈玉先 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2010年第6期733-736,共4页

目的构建具有绿色荧光蛋白(GFP)标签的α1抗胰蛋白酶Z突变型(ATZ)的真核表达载体,在人胚胎肾细胞(HEK293T)中验证表达情况及检测其对细胞的影响。方法以pcDNA3.1-zeo+-ATZ质粒为模版,设计引物,PCR扩增出ATZ的cDNA序列,插入真核表达载体p... 目的构建具有绿色荧光蛋白(GFP)标签的α1抗胰蛋白酶Z突变型(ATZ)的真核表达载体,在人胚胎肾细胞(HEK293T)中验证表达情况及检测其对细胞的影响。方法以pcDNA3.1-zeo+-ATZ质粒为模版,设计引物,PCR扩增出ATZ的cDNA序列,插入真核表达载体pEGFP-C1中,构建带有GFP标签的ATZ真核表达载体pEGFP-C1-ATZ,脂质体转染体外培养的HEK293T细胞,Western blot、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测GFP-ATZ在细胞中的表达、分布情况及其对细胞形态和分裂的影响。结果 ATZ片段成功插入pEGFP-C1表达质粒,在表达GFP的HEK293T细胞内,绿色荧光呈弥散的全细胞分布,而表达GFP-ATZ的细胞绿色荧光分布于细胞质内;Western blot结果显示特异性条带,分子量大小与GFP-ATZ预期相符;GFP-ATZ的过度表达引起细胞出现不同程度的形态改变、分裂障碍、聚集体出现甚至死亡。结论成功构建了具有绿色荧光标记的ATZ真核表达载体,GFP-ATZ的表达具有细胞毒性。 展开更多

关键词 α1抗胰蛋白酶缺乏症/遗传学 突变基因表达 转染

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Ser^(202)/Thr^(205)位点磷酸化tau在神经元中的定位 被引量：8

8

作者 孙爱民 王海萍 +2 位作者 沈玉君 沈玉先 方圣云 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期41-45,共5页

目的观察Ser202/Thr205位点的过度磷酸化tau在神经元中的定位和聚集情况。方法取孕18 d SD胎鼠皮层神经元进行原代培养,于培养第9天加入冈田酸(okadaic acid,OA)处理12 h以诱导tau蛋白磷酸化;同时用OA诱导SH-SY5Y细胞;观察tau磷酸化后... 目的观察Ser202/Thr205位点的过度磷酸化tau在神经元中的定位和聚集情况。方法取孕18 d SD胎鼠皮层神经元进行原代培养,于培养第9天加入冈田酸(okadaic acid,OA)处理12 h以诱导tau蛋白磷酸化;同时用OA诱导SH-SY5Y细胞;观察tau磷酸化后神经元形态的变化;用AT-8抗体免疫荧光染色观察Ser202/Thr205位点磷酸化tau的定位和聚集;同时应用AT-8抗体和Tau-5抗体检测tau蛋白Ser202/Thr205位点的磷酸化水平变化情况。结果经过Anti-NeuN和Anti-GFAP免疫染色鉴定,孕18 d胎鼠皮层神经元选择性原代培养成功。OA处理12 h以后,Ser202/Thr205位点磷酸化tau的水平明显增加,且出现高分子量的寡聚体;免疫荧光染色发现,Ser202/Thr205位点磷酸化的tau在原代培养神经元的胞质聚集;而OA处理的SH-SY5Y细胞,Ser202/Thr205位点磷酸化的tau却定位于细胞核。同时发现OA处理的原代神经元突起明显减少或消失。结论 OA能够诱导原代培养的胎鼠神经元tau蛋白在Ser202/Thr205位点过度磷酸化,且该磷酸化tau在不同类型或来源的神经元中的定位不同。 展开更多

关键词 冈田酸 胎鼠皮层神经元 tau 过度磷酸化 阿尔采末病 磷酸化位点

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佐剂性关节炎大鼠滑膜及血清中MANF的表达及其与炎症的相关性 被引量：9

9

作者 马钰泱 狄泽敏 +3 位作者 曹晴 沈玉君 沈玉先 冯利杰 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期537-543,共7页

目的观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠膝关节滑膜和血清中的表达情况,分析MANF表达与关节炎症是否具有相关性。方法 SD大... 目的观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠膝关节滑膜和血清中的表达情况,分析MANF表达与关节炎症是否具有相关性。方法 SD大鼠足趾皮内注射弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant,FCA)制备AA模型;足容积法测量继发侧足肿胀度,关节炎指数(arthritis index,AI)评价AA严重程度,HE染色观察膝关节病理学变化;分别采用Western blot和RT-PCR法检测致炎后不同时期继发侧膝关节滑膜组织中MANF和内质网应激标志蛋白BiP、CHOP的蛋白和mRNA水平;ELISA法检测致炎后不同时期血清中MANF、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)水平,并进行相关性分析。结果 AA大鼠模型建立成功,致炎d 2滑膜组织中BiP表达明显升高,到d 28稍有下降;MANF表达在致炎d 2略有升高并保持稳定,d 14表达明显上调,随后逐渐下降;而CHOP则保持低水平缓慢上升的趋势;致炎d 14血清中MANF水平明显增高,随后逐渐下降,d 28仍高于正常水平;CRP与MANF变化趋势基本一致;在AA大鼠继发性反应期,MANF水平与关节炎症状、血清IL-1β和TNF-α水平呈负相关。结论关节炎症能诱导MANF表达和分泌,且MANF水平与关节炎症进展和程度密切相关。 展开更多

关键词 类风湿性关节炎 内质网应激 未折叠蛋白反应 MANF 分泌性蛋白 炎症因子

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中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子对糖氧剥夺/再灌注诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 被引量：3

10

作者 孙瑞 刘珺 +3 位作者 沈玉君 沙曼琪 徐胜春 沈玉先 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期810-815,共6页

目的研究中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)对糖氧剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用。方法... 目的研究中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)对糖氧剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用。方法体外培养SH-SY5Y细胞,对细胞进行糖氧剥夺(OGD)6 h,再灌注(R)12 h。在再灌注时期,根据是否给予重组人MANF蛋白处理(2μmol·L-1,12 h),将细胞分为正常对照组(NC)、NC+MANF组、OGD/R组和OGD/R+MANF组。随后光学显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态的改变,MTT法检测细胞存活率,PI染色法检测细胞死亡率,免疫印迹法检测内源性MANF蛋白、内质网(ER)应激相关蛋白GRP78/Bi P、p-IRE1、p-e IF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表达。结果光学显微镜下可见OGD/R组SH-SY5Y细胞胞体变小、变圆,突起缩短或消失。进一步研究发现,MANF能明显改善OGD/R诱导的SHSY5Y细胞存活率下降和死亡率增加。免疫印迹法检测发现:OGD/R组细胞内源性MANF蛋白表达增高;ER应激相关蛋白GRP78/Bi P、p-IRE1、p-e IF2α表达增高;促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表达明显高于NC组。给予重组人MANF蛋白可降低OGD/R组GRP78/Bi P、CHOP及cleaved caspase-3的表达水平。结论 OGD/R可诱导凋亡性ER应激;MANF蛋白可通过抑制OGD/R诱导的凋亡性ER应激而对SH-SY5Y细胞具有保护作用。 展开更多

关键词 糖氧剥夺/再灌注 内质网应激 凋亡 MANF 非折叠蛋白反应 神经保护

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子宫颈酸性磷酸酶在恶性子宫颈鳞状上皮细胞中异常表达 被引量：3

11

作者 胡健力 李洪言 +3 位作者 魏兆莲 孟刚 方圣云 沈玉先 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期481-483,共3页

目的观察子宫颈酸性磷酸酶(cervical acid phosphatase,CAP)在子宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)中的异常表达。方法选择30例确诊为子宫颈SCC的住院患者,手术前采集子宫颈涂片,分别进行传统的巴氏染色和CAP检测。CAP的检... 目的观察子宫颈酸性磷酸酶(cervical acid phosphatase,CAP)在子宫颈鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)中的异常表达。方法选择30例确诊为子宫颈SCC的住院患者,手术前采集子宫颈涂片,分别进行传统的巴氏染色和CAP检测。CAP的检测采用FSC-811染色试剂盒,细胞胞质中出现红色物质为CAP阳性。巴氏染色结果的判定采用TBS分级系统。结果正常的子宫颈鳞状上皮细胞中CAP表达为阴性,而正常的子宫颈管细胞中CAP表达阳性;30例诊断为子宫颈SCC的患者子宫颈涂片中CAP均为阳性。典型的CAP细胞内分布呈颗粒状,这可能与溶酶体的分布一致。结论 CAP在子宫颈SCC中的表达或活性增加,提示CAP有可能成为子宫颈SCC的生物标记物。 展开更多

关键词 子宫颈肿瘤 鳞状细胞 酸性磷酸酶 FSC-811 巴氏染色

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大鼠出生后不同时期脾脏结构发育和浆细胞分化 被引量：3

12

作者 周宬玥 冯利杰 +2 位作者 沈玉君 黄大可 沈玉先 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2012年第7期796-799,共4页

目的观察大鼠出生后不同发育阶段脾脏的结构变化和CD138阳性的浆细胞分化。方法选取不同发育时期(出生后1、2、3、4、6、8、10、12、22周)大鼠的脾脏,并制备组织标本。分别采用HE染色和免疫组织化学技术,观察脾脏的结构发育及CD138、CD6... 目的观察大鼠出生后不同发育阶段脾脏的结构变化和CD138阳性的浆细胞分化。方法选取不同发育时期(出生后1、2、3、4、6、8、10、12、22周)大鼠的脾脏,并制备组织标本。分别采用HE染色和免疫组织化学技术,观察脾脏的结构发育及CD138、CD68的表达。结果大鼠在出生后1～4周,脾脏的白髓和红髓发育不成熟,没有完整的白髓结构和血管结构,脾脏组织中无CD138阳性的浆细胞;大鼠在出生6周后,脾脏的白髓和红髓中出现血管样结构和少量的CD138阳性细胞;8周时白髓具有典型的结构特征,并有大量的CD138阳性细胞;大鼠出生后1周,脾脏组织中有大量的、散在分布的、呈分枝状的CD68阳性的细胞,而在出生6周后,巨噬细胞呈圆形或阿米巴状,细胞内CD68的表达量也明显增加。结论浆细胞的分化滞后于巨噬细胞,出生早期机体主要以非特异性免疫为主。 展开更多

关键词 浆细胞 巨噬细胞 脾脏发育

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人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析 被引量：2

13

作者 张栋 李苗苗 +4 位作者 董阳 刘星赟 应松成 方圣云 沈玉先 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2017年第11期1592-1596,共5页

目的鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制。方法从Hep G2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段... 目的鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制。方法从Hep G2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段。将扩增出的4个片段连入p MD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入p GL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定。将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染Hep G2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性。5'RACE鉴定SAMHD1在Hep G2细胞中的转录起始位点。结果电泳结果显示已经从Hep G细胞中提取出基因组DNA。PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段。双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入p MD19-T载体。双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体p GL3-937、p GL3-667、p GL3-553和p GL3-399。荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0^-399区域(ATG前一个碱基为-1)。5'RACE结果显示SAMHD1在Hep G2细胞中转录起始位点位于-101。结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101^-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础。 展开更多

关键词 SAMHD1 核心启动子 转录起始位点 转录调控

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MANF减轻帕金森病大鼠模型的神经损伤 被引量：1

14

作者 汪运红 沈玉君 +3 位作者 冯利杰 王海萍 方圣云 沈玉先 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2012年第7期781-785,共5页

目的观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)对6-OHDA引起的多巴胺能神经元损伤的影响。方法表达纯化人重组MANF蛋白;将6-OHDA立体定位注射至大鼠纹状体区,制备大鼠帕金森模型;将3个剂量(5、10、20μg)纯化的MANF注射至模型大鼠纹... 目的观察中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(MANF)对6-OHDA引起的多巴胺能神经元损伤的影响。方法表达纯化人重组MANF蛋白;将6-OHDA立体定位注射至大鼠纹状体区,制备大鼠帕金森模型;将3个剂量(5、10、20μg)纯化的MANF注射至模型大鼠纹状体区,腹腔注射司来吉兰作为阳性对照,纹状体直接注射PBS作为阴性对照;计数大鼠给药前后由阿扑吗啡诱导的由损伤侧向健侧不对称的旋转次数;免疫组化方法检测各大鼠黑质、纹状体部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元和神经纤维。结果 10μg MANF组大鼠的旋转行为较PBS组明显减少,效果与司来吉兰组相近。MANF注射后对黑质部位TH阳性神经元数量和纹状体部位TH阳性神经纤维数量均有不同程度的明显恢复。结论 MANF能减轻6-OHDA引起的帕金森模型大鼠的神经损伤。 展开更多

关键词 MANF 帕金森病 动物模型 6-OHDA

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乙肝病毒HBx基因稳转细胞系的建立及其诱导的内质网应激 被引量：1

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作者 陆鹏 姜同翠 +3 位作者 陈露 沈玉君 沈玉先 方圣云 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2014年第3期283-287,共5页

目的建立乙肝病毒(HBV)HBx基因稳转细胞系,并观察该细胞系的增殖活性及内质网应激相关基因的表达情况。方法采用RT-PCR法从HepG2.2.15细胞株中克隆HBx基因编码区片段,构建pcDNA3.1-HBx真核表达质粒。利用脂质体将pcDNA3.1-HBx转染至人He... 目的建立乙肝病毒(HBV)HBx基因稳转细胞系,并观察该细胞系的增殖活性及内质网应激相关基因的表达情况。方法采用RT-PCR法从HepG2.2.15细胞株中克隆HBx基因编码区片段,构建pcDNA3.1-HBx真核表达质粒。利用脂质体将pcDNA3.1-HBx转染至人HepG2细胞系,通过G418筛选后,经Western blot法对HBx的表达进行验证。并用MTT法检测细胞的增殖活性,同时观察过表达HBx蛋白对内质网应激相关基因表达的影响。结果成功构建了HBx的真核表达质粒;建立了HBV HBx基因稳转细胞系;MTT法检测显示该细胞系增殖活性明显上升;同时也发现HBx基因的过表达可上调内质网应激相关基因BiP、PERK、ATF6、XBP1、MANF的表达,而CHOP的表达降低。结论 HBx基因过表达可诱导内质网应激,并促进HepG2细胞增殖。 展开更多

关键词 细胞增殖 内质网应激

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人中脑星形胶质来源的神经营养因子基因启动子区域的克隆及活性检测

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作者 张利 陆鹏 +1 位作者 王涛 沈玉先 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期783-786,共4页

目的克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性。方法利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件。以HepG2细胞的总基因组... 目的克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性。方法利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件。以HepG2细胞的总基因组为模板,通过PCR反应扩增了MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段,并将此片段插入到不含有启动子的pEGFP-1载体中构建了pEGFP-1-MANF-5F重组质粒。用脂质体介导的方法将pEGFP-1-MANF-5F质粒转染到293T细胞,在倒置显微镜下观察绿色荧光的表达。同时,将上述MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,以构建质粒pGL3-MANF-5F,并通过共转染内参质粒pRL-TK到N2 A细胞中,24 h后检测双荧光素酶的表达。结果重组质粒pEGFP-1-MANF-5F转染293T细胞后,在细胞中可见绿色荧光蛋白;pGL3-MANF-5F重组质粒在N2 A细胞中检测到双荧光素酶的活性,且在Tunicamycin诱导时表达明显升高;结论已成功克隆了MANF基因的5'端非翻译区,并证实该区域具有启动子活性,且内质网应激可调节MANF的启动子活性,这为进一步研究MANF基因在疾病中的表达调控机制奠定了基础。 展开更多

关键词 MANF 内质网应激 启动子 转录调控 克隆 ERSE

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