猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据...猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据PCV2、PCV3和PCV4的rep基因序列,设计特异性引物和探针,利用三维响应面曲线优化扩增条件,建立了一种可同时检测3种PCV的三重Taq Man qPCR方法。通过将扩增的PCV2、PCV3、PCV4的rep基因片段克隆至pUC-57载体,构建重组质粒标准品,并经测序鉴定。特异性试验中,结果显示该方法仅对PCV2、PCV3、PCV4检测为阳性,对其他常见猪病毒及细菌检测结果均为阴性,特异性强;敏感性试验中,使用构建的3种重组质粒标准品等体积混合再10倍倍比稀后经该三重qPCR检测,结果显示该方法对PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品的检测限分别为1×10^(1)拷贝/μL、1×10^(2)拷贝/μL、1×10^(0)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验中,采用本研究建立的三重qPCR方法分别对3种浓度PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品进行组内和组间重复性检测,结果显示该方法组内和组间重复性试验的变异系数分别小于3.34%和2.77%,重复性较好。利用该方法检测浙江省送检的共120份仔猪组织病料及肛拭子样品,并利用已发表的检测PCV2、PCV3及PCV4的SYBR Green I qPCR方法同时检测,结果显示,本研究建立的方法对PCV2的检出率为60.8%(73/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为25.8%(31/120);SYBR Green I qPCR法对PCV2的检出率为65%(78/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为27.5%(33/120);两种检测方法的总符合率均为92.5%(111/120)。本研究首次建立了可用于鉴别检测临床样品中PCV2、PCV3、PCV4感染的q PCR鉴别检测方法,为猪场PCV感染的防控奠定基础。展开更多
Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-eg...Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P<0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P<0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P<0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。展开更多
文摘猪圆环病毒2型(PCV2)可引起仔猪的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,PCV基因型多且常以混合感染为主,给养殖场造成严重经济损失。为建立一种能同时检测PCV2、PCV3、PCV4的荧光定量PCR(q PCR)方法,本研究根据PCV2、PCV3和PCV4的rep基因序列,设计特异性引物和探针,利用三维响应面曲线优化扩增条件,建立了一种可同时检测3种PCV的三重Taq Man qPCR方法。通过将扩增的PCV2、PCV3、PCV4的rep基因片段克隆至pUC-57载体,构建重组质粒标准品,并经测序鉴定。特异性试验中,结果显示该方法仅对PCV2、PCV3、PCV4检测为阳性,对其他常见猪病毒及细菌检测结果均为阴性,特异性强;敏感性试验中,使用构建的3种重组质粒标准品等体积混合再10倍倍比稀后经该三重qPCR检测,结果显示该方法对PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品的检测限分别为1×10^(1)拷贝/μL、1×10^(2)拷贝/μL、1×10^(0)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验中,采用本研究建立的三重qPCR方法分别对3种浓度PCV2、PCV3、PCV4重组质粒标准品进行组内和组间重复性检测,结果显示该方法组内和组间重复性试验的变异系数分别小于3.34%和2.77%,重复性较好。利用该方法检测浙江省送检的共120份仔猪组织病料及肛拭子样品,并利用已发表的检测PCV2、PCV3及PCV4的SYBR Green I qPCR方法同时检测,结果显示,本研究建立的方法对PCV2的检出率为60.8%(73/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为25.8%(31/120);SYBR Green I qPCR法对PCV2的检出率为65%(78/120),对PCV3的检出率为45.8%(55/120),对PCV4的检出率为27.5%(33/120);两种检测方法的总符合率均为92.5%(111/120)。本研究首次建立了可用于鉴别检测临床样品中PCV2、PCV3、PCV4感染的q PCR鉴别检测方法,为猪场PCV感染的防控奠定基础。
