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兰州鲇精液超低温冷冻保存技术研究及细胞损伤检测 被引量：15
1
作者 邢露梅 肖伟 +5 位作者 李兰兰 张利平 赛清云 俞兆曦 吴旭东 连总强 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期547-556,共10页
为保护兰州鲇(Silurus lanzhouensis Chen)种质资源,促进新品种选育,文章开展了兰州鲇精液超低温冻存抗冻剂筛选及程序保存技术研究,并通过精子解冻激活率、核DNA检测、扫描电镜和透射电镜检测技术对冻存效果和冻存损伤情况进行了评测... 为保护兰州鲇(Silurus lanzhouensis Chen)种质资源,促进新品种选育,文章开展了兰州鲇精液超低温冻存抗冻剂筛选及程序保存技术研究,并通过精子解冻激活率、核DNA检测、扫描电镜和透射电镜检测技术对冻存效果和冻存损伤情况进行了评测。结果表明:兰州鲇精液以10%DMSO为抗冻剂, 4℃平衡20min,–80℃平衡30min后立即置于液氮超低温保存,并于40℃水浴解冻时精子冻存效果较佳,冻精激活率达(75.56±3.91)%。SCGE检测DNA损伤结果显示超低温冻存10d、20d及30d兰州鲇精液的彗星率和损伤系数无显著差异。扫描电镜检测显示兰州鲇精子明显分头部,中段及尾部3部分,属于单鞭毛型,无顶体,无侧鳍,中心粒相互垂直呈"T"形,鞭毛为典型的"9+2"微管结构。冻存结构损伤主要表现为膜损伤,细胞质膜与染色质膜发生破损、折皱、囊泡化或整体脱落,细胞核膜与质膜空隙加大,核发生变形,核质疏散,线粒体结构弥散,线粒体内容物外流,中心粒复合体易位,鞭毛外膜变形脱离,中段位置断裂,微管结构基本完好。研究筛选的超低温冷冻保存技术可长期有效保存兰州鲇精液,为兰州鲇种质资源保护及今后精液超低温冷冻保存技术改良提供理论依据和技术基础。 展开更多
关键词 兰州鲇 精液 超低温冷冻 细胞损伤 超微结构
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兰州鲇性腺型芳香化酶cyp19a1a基因克隆及表达定位分析 被引量：5
2
作者 李敏敏 俞兆曦 +7 位作者 张利平 刘凯 肖伟 刘彦斌 赛清云 田永华 吴旭东 连总强 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期654-667,共14页
【目的】性腺型芳香化酶基因cyp19a1a在硬骨鱼类性腺发育和性别决定过程中具有重要作用,克隆分析该基因在生长和体型性状具有性别二态性兰州鲇(Silurus lanzhouensis)不同组织的表达与定位,并对已获得YY超雄个体的雌雄同体亲本进行不同... 【目的】性腺型芳香化酶基因cyp19a1a在硬骨鱼类性腺发育和性别决定过程中具有重要作用,克隆分析该基因在生长和体型性状具有性别二态性兰州鲇(Silurus lanzhouensis)不同组织的表达与定位,并对已获得YY超雄个体的雌雄同体亲本进行不同组织表达验证分析,为加快培育全雄兰州鲇良种新品种提供理论依据和技术支撑。【方法】采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)法获得兰州鲇cyp19a1a全长cDNA序列,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测该基因在3月龄、1龄和3龄兰州鲇正常雌雄鱼和3龄雌雄同体鱼的不同组织表达,并采用免疫组织化学法(IHC)分别检测该基因在3月龄、1龄和3龄正常雌性鱼性腺组织的表达与定位。【结果】cyp19a1a c DNA序列全长为2168 bp,其中5′非编码区(Untranslated region,UTR)53 bp,开放阅读框(OFR)1707 bp,3′UTR408 bp,编码568个氨基酸残基,具有芳香化酶氨基酸序列的保守功能区。兰州鲇cyp19a1a mRNA主要在性腺表达,3龄雌雄同体表达特征与3龄正常繁育个体相同,且卵巢表达量显著高于精巢(P<0.05);正常繁育养殖个体表达量随性腺发育而显著增加。IHC结果显示,不同时期卵巢组织中,卵原细胞仅在3月龄和1龄分布且没有发现阳性信号,卵母细胞在不同时期均有分布且信号随着卵母细胞发育而逐渐增强,其中3月龄至1龄主要分布于胞质,3龄时主要分布于胞质、滤泡膜以及放射膜和鞘膜细胞;不同时期精巢组织中仅在间质细胞有微弱表达。【结论】cyp19a1a基因在兰州鲇卵巢发育和卵细胞生长发育过程中都具有重要作用,对精巢发育和维持以及精子发生具有一定的促进作用,在雌雄同体兰州鲇性腺中的作用和兰州鲇正常繁育个体一致。本研究为鱼类性别决定与分化以及性腺发育调控机制提供了重要的理论依据。 展开更多
关键词 兰州鲇 雌雄同体 cyp19a1a基因 基因克隆 性腺发育 mRNA表达 细胞定位
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基于微卫星多重PCR技术的兰州鲇亲子鉴定 被引量：11
3
作者 李兰兰 邢露梅 +7 位作者 俞兆曦 肖伟 赛清云 刘彦斌 田永华 王燕 刘哲 连总强 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期530-540,共11页
针对目前兰州鲇(Silurus lanzhouensis)种质资源救护保存和良种选育等研究工作中面临的亲子鉴定及系谱管理等问题,研究应用微卫星荧光标记多重PCR与自动测序分型技术,建立了2组四重PCR和2组三重PCR体系,并成功应用于3个家系亲子鉴定中... 针对目前兰州鲇(Silurus lanzhouensis)种质资源救护保存和良种选育等研究工作中面临的亲子鉴定及系谱管理等问题,研究应用微卫星荧光标记多重PCR与自动测序分型技术,建立了2组四重PCR和2组三重PCR体系,并成功应用于3个家系亲子鉴定中。利用Cervus v.3.0软件对110尾兰州鲇进行遗传多样性分析,结果显示:研究筛选的14个微卫星标记的平均观测杂合度(H_o)为0.750,平均期望杂合度(H_e)为0.667,平均多态信息含量(PIC)为0.624,具有丰富的遗传多样性。对已知系谱信息的3个兰州鲇家系的90尾子代和20尾候选亲本进行亲子鉴定分析,结果表明,双亲基因型未知累积排除概率(CE-1P)、单亲基因型已知累积排除概率(CE-2P)和双亲基因型已知累积排除概率(CE-PP)分别为0.99753092、0.99983971和0.99999964。4组多重PCR累积模拟鉴定率为100%,累积实际鉴定率为83%。采用50尾个体进行双盲验证,利用MEGA7.0对3个家系50尾个体进行聚类分析,结果表明同一家系94%的个体聚类分析结果与系谱关系一致。研究构建的兰州鲇4组微卫星多重PCR亲子鉴定技术为兰州鲇不同种质混养保存、种质选配扩繁、选育系谱管理和分子标记辅助选育等提供了重要技术支持。 展开更多
关键词 兰州鲇 微卫星 多重PCR 亲子鉴定
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兰州鲇Dmrta1基因克隆及其组织时空表达规律 被引量：1
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作者 柳婷 李敏敏 +10 位作者 赖章龙 刘彦斌 刘凯 肖伟 赛清云 田永华 杨立强 阮超岭 杨瑞兰 刘哲 连总强 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2023年第6期228-238,共11页
为了解Dmrta1基因的生物学特性及其在兰州鲇生长发育中的生理作用,以及为加快实现全雄兰州鲇群体生产提供理论依据和技术支撑。采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得兰州鲇Dmrta1全长cDNA序列,通过qRT-PCR技术检测该基因在兰... 为了解Dmrta1基因的生物学特性及其在兰州鲇生长发育中的生理作用,以及为加快实现全雄兰州鲇群体生产提供理论依据和技术支撑。采用同源克隆和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得兰州鲇Dmrta1全长cDNA序列,通过qRT-PCR技术检测该基因在兰州鲇胚胎发育、仔稚幼鱼以及3龄雌雄异体和3龄雌雄同体不同组织中的表达特征。结果表明,兰州鲇Dmrta1基因cDNA全长1415 bp,ORF全长1158 bp,共编码385个氨基酸,包含20种氨基酸;经SMART预测显示,该基因属于典型的Dmrta亚家族蛋白,具有保守的DM和DMA结构域。同源性比对和系统进化树分析结果表明,兰州鲇与南方鲇的相似性最高(95.47%),且亲缘关系最近。组织表达结果表明,Dmrta1 mRNA在未受精卵粒及胚胎发育各个时期均有表达,而在未受精卵粒中表达最高(P<0.05);在兰州鲇孵化后40 d内不同发育时期中,Dmrta1 mRNA在同期XX个体组织中表达均显著高于XY个体,且在35 d迅速达到峰值(P<0.05);Dmrta1 mRNA在3龄雌雄异体兰州鲇雌性卵巢、鳃和雄性鳃组织中表达显著高于其他组织(P<0.05),且卵巢表达显著高于雌性和雄性鳃,除卵巢表达是精巢的47.07倍外,其他组织中不存在雌雄性别差异;3龄雌雄同体和3龄雌雄异体表达特征一致,都是卵巢表达显著高于鳃和精巢(P<0.05)。以上结果说明,Dmrta1基因属于母源基因,该基因可能在兰州鲇性别分化、卵子形成和鳃弓形成过程中发挥重要作用,在雌雄同体和雌雄异体兰州鲇性腺中的作用一致。 展开更多
关键词 兰州鲇 Dmrta1基因 基因克隆 早期生活史 雌雄同体 MRNA表达
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兰州鲇NPY基因的克隆和表达分析 被引量：1
5
作者 赖章龙 阮超岭 +11 位作者 肖伟 刘彦斌 俞兆曦 刘凯 赛清云 田永华 张锋 杨瑞兰 柳婷 杨立强 王玉涛 连总强 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2023年第5期227-238,共12页
针对兰州鲇人工驯食转化率、苗种培育成活率低等问题,为利用基因编辑技术创制和培育易驯食兰州鲇新种质,开展了兰州鲇神经肽Y基因(NPY)的克隆及其表达分析研究。结果表明:兰州鲇NPY基因cDNA序列全长为775 bp,包括288 bp的开放阅读框,编... 针对兰州鲇人工驯食转化率、苗种培育成活率低等问题,为利用基因编辑技术创制和培育易驯食兰州鲇新种质,开展了兰州鲇神经肽Y基因(NPY)的克隆及其表达分析研究。结果表明:兰州鲇NPY基因cDNA序列全长为775 bp,包括288 bp的开放阅读框,编码95个氨基酸,含有1个跨膜螺旋和1个信号肽胰腺激素类识别结合位点。兰州鲇NPY蛋白序列与南方鲇的一致性最高,为98.95%。荧光定量PCR检测发现NPY mRNA在脑组织中表达量最高,其次是下丘脑,肌肉中表达量最低。不同年龄雄性各组织中NPY mRNA表达水平均高于雌性;且雌雄性别组间均表现出随年龄的增长NPY mRNA表达下降的特征。利用原位杂交技术进行脑组织细胞定位发现,脑细胞中NPY主要在细胞质中表达;不同部位脑组织中主要以前脑的视前区、视顶盖和脑垂体,小脑的豆状核区域以及延脑的尾状核区域表达量较丰富。进一步进行饥饿补偿验证发现,饥饿可引起脑组织NPY表达量显著升高,摄食后NPY表达量显著下降。上述结果表明,NPY基因可能在兰州鲇生长和摄食过程中都具有重要作用,可作为对后续功能基因进行编辑的重要验证并创制新种质,对加快兰州鲇良种新品种选育具有重要的理论意义和技术支撑作用。 展开更多
关键词 兰州鲇 NPY基因 生物信息学 基因克隆 原位杂交 组织表达
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野生和养殖兰州鲇肠道菌群结构的比较 被引量：5
6
作者 阮超岭 赖章龙 +11 位作者 肖伟 俞兆曦 刘凯 刘彦斌 赛清云 田永华 李敏敏 柳婷 杨立强 杨瑞兰 连总强 王玉涛 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1734-1744,共11页
研究以不同生境兰州鲇群体为研究对象,通过细菌16S rDNA V3—V4区域高通量测序的方法,开展不同环境下肠道菌群组成、丰富度、多样性差异和功能预测的研究。实验共分为4组,其中养殖型为池塘组(CT)和网箱组(WX);野生型为陶乐组(TL)和磴口... 研究以不同生境兰州鲇群体为研究对象,通过细菌16S rDNA V3—V4区域高通量测序的方法,开展不同环境下肠道菌群组成、丰富度、多样性差异和功能预测的研究。实验共分为4组,其中养殖型为池塘组(CT)和网箱组(WX);野生型为陶乐组(TL)和磴口组(DK)。结果显示,兰州鲇肠道核心菌门为梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria);核心菌属为鲸杆菌属(Cetobacterium)和邻单胞菌属(Plesiomonas)。肠道菌群α和β多样性分析结果显示,26.5℃较20℃的兰州鲇肠道菌群多样性更高;单一种类的网箱养殖较其他养殖模式的兰州鲇肠道菌群多样性更低。进一步对兰州鲇肠道菌群组成及丰度进行组间差异性分析,结果显示,CT组拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度与TL组有极显著差异(P≤0.01)、与WX组有显著性差异(P≤0.05);而CT组放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度显著高于野生型两组(P≤0.05),甲基杆菌属(Methylobacterium)丰度显著高于WX组和TL组(P≤0.05)。进一步结合环境因子分析表明,温度、pH和氨氮浓度可能是兰州鲇肠道菌群组成和丰度的重要影响因素。预测的肠道菌群功能表明,不同的环境会影响兰州鲇肠道菌群的代谢能力。综上所述,不同的生长环境对兰州鲇肠道菌群的组成、丰富度和预测的菌群功能具有显著影响,这有助于通过改善pH、温度和氨氮浓度,有效控制兰州鲇肠道菌群,进而降低兰州鲇患病概率和提高兰州鲇苗种的驯食转化率,从而促进兰州鲇养殖业的可持续发展。 展开更多
关键词 16S rDNA 肠道菌群 多样性差异 功能预测 兰州鲇
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