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葡萄糖转运蛋白GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠视网膜中的表达 被引量：1
1
作者 白文帆 郭玉 +3 位作者 伏等弟 罗明秀 芦晓红 姚青 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2024年第4期270-274,共5页
目的 探讨葡萄糖转运蛋白GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠视网膜中的表达。方法 取8周龄健康雄性SD大鼠20只随机分为正常对照组和糖尿病组,糖尿病组大鼠按照60 mg·kg^(-1)的剂量采用一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型,正常对... 目的 探讨葡萄糖转运蛋白GLUT1/4和Sirtuins在糖尿病大鼠视网膜中的表达。方法 取8周龄健康雄性SD大鼠20只随机分为正常对照组和糖尿病组,糖尿病组大鼠按照60 mg·kg^(-1)的剂量采用一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型,正常对照组大鼠注射等量的溶剂。每隔2周检测大鼠体重和血糖。造模后12周,应用彩色多普勒超声检测大鼠视网膜中央动脉(CRA)血流参数;使用戊巴比妥钠麻醉大鼠后摘取眼球,采用HE染色观察大鼠视网膜组织的病理变化,免疫组织化学染色、Western blot和qRT-PCR分别检测大鼠视网膜中GLUT1/4和Sirtuins mRNA的表达情况。结果 造模后12周,与正常对照组相比,糖尿病组大鼠CRA的收缩期峰值流速和舒张末期流速均显著降低(均为P<0.001);阻力指数和搏动指数无明显改变(均为P>0.05)。造模后12周HE染色结果显示,正常对照组大鼠视网膜组织各层结构清晰,细胞排列紧密、规则,未发现明显的病理改变;糖尿病组大鼠视网膜组织厚度变薄,各层界限模糊,结构紊乱,细胞数量减少。造模后12周免疫组织化学染色结果显示,在大鼠视网膜中,GLUT1主要位于视网膜色素上皮层,GLUT4位于神经节细胞层、内丛状层及光感受器层;Western blot检测结果显示,糖尿病组大鼠视网膜中GLUT1及GLUT4蛋白相对表达量均低于正常对照组(均为P<0.05),糖尿病组大鼠视网膜中SIRT1-SIRT7蛋白相对表达量均低于正常对照组(均为P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,与正常对照组相比,糖尿病组大鼠视网膜中的SIRT1-SIRT7 mRNA相对表达量均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。结论 糖尿病可引起大鼠视网膜组织中GLUT1/4和Sirtuins的表达发生改变,GLUT1/4和Sirtuins可能参与了DR的发生与发展。 展开更多
关键词 糖尿病视网膜病变 葡萄糖转运蛋白 SIRTUINS 视网膜中央动脉
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类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞中膜联蛋白A2磷酸化修饰增强基质金属蛋白酶9的活性 被引量：3
2
作者 赵薇 穆楠 +2 位作者 舒震 张昭 张伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1363-1366,1371,共5页
目的研究膜联蛋白A2(ANXA2)磷酸化修饰对类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RAFLS)基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9水平及活性的影响。方法原代培养RAFLS,构建包装ANXA2干涉慢病毒,制备ANXA2显著下调的FLS(si ANXA2/FLS)及同型对照作... 目的研究膜联蛋白A2(ANXA2)磷酸化修饰对类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RAFLS)基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9水平及活性的影响。方法原代培养RAFLS,构建包装ANXA2干涉慢病毒,制备ANXA2显著下调的FLS(si ANXA2/FLS)及同型对照作为细胞模型,采用2型胶原蛋白刺激法间接磷酸化RAFLS中的ANXA2。实时定量PCR(qRT-PCR)分析ANXA2磷酸化对RAFLS细胞中MMP-2和MMP-9表达的影响,明胶酶谱实验观察ANXA2活化对RAFLS中MMP-2和MMP-9活性的影响。结果 qRT-PCR结果提示ANXA2磷酸化修饰对RAFLS中MMP-2和MMP-9的水平无显著影响,明胶酶谱实验显示ANXA2磷酸化修饰能够增强MMP-9的活性。结论通过胶原蛋白刺激法间接促进RAFLS中ANXA2的磷酸化修饰,显著增强MMP-9的活性。 展开更多
关键词 类风湿性关节炎 成纤维样滑膜细胞 膜联蛋白A2 基质金属蛋白酶9 明胶酶谱
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犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用 被引量：2
3
作者 张茜 闫琰 +4 位作者 马婧 李建宁 张薇 黄菱 孙玉宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期253-257,共5页
目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32... 目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性。结果通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体p ET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶6 400 000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性。结论成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体。 展开更多
关键词 犬博卡病毒(CBV) 结构基因VP2 多克隆抗体
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犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定 被引量：2
4
作者 闫琰 张茜 +3 位作者 马婧 李建宁 张薇 孙玉宁 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期864-869,I0006,共7页
目的:制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法:以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘... 目的:制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法:以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NP1蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备NP1抗血清并用ELISA法测定抗血清效价。采用Western blotting和免疫荧光法检测NP1抗血清的特性。结果:成功构建MVC NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的NP1融合蛋白,以其免疫大白兔获得NP1多抗血清,ELISA法检测效价达到1∶400 000。Western blotting法及免疫荧光检测,所得抗血清具有较高的效价及特异性。结论:本研究利用原核表达的MVC GST-NP1融合蛋白制备的NP1抗血清效价高、特异性高,为进一步深入研究NP1在MVC感染及致病分子机制中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 犬博卡病毒 NP1基因 多克隆抗体
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小鼠Ccr2基因真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立 被引量：1
5
作者 赵薇 芦晓红 裴秀英 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1214-1216,1219,共4页
目的:构建小鼠Ccr2基因真核表达载体,转染RAW264.7,建立稳定转染Ccr2的RAW264.7细胞系。方法:应用RT-PCR从小鼠脾脏组织中扩增Ccr2mRNA全序列,插入真核表达载体pEGFP-N1中。用脂质体将重组质粒pEGFP-N1/Ccr2转染RAW264.7细胞,通过G418... 目的:构建小鼠Ccr2基因真核表达载体,转染RAW264.7,建立稳定转染Ccr2的RAW264.7细胞系。方法:应用RT-PCR从小鼠脾脏组织中扩增Ccr2mRNA全序列,插入真核表达载体pEGFP-N1中。用脂质体将重组质粒pEGFP-N1/Ccr2转染RAW264.7细胞,通过G418筛选建立Ccr2稳定转染的RAW264.7细胞系。经RT-PCR、Western blot检测、荧光显微镜和流式细胞仪FCM检测,了解Ccr2在RAW264.7细胞中的表达水平及细胞内定位。结果:成功构建了pEGFP-N1/Ccr2重组质粒,建立了稳定转染的RAW264.7细胞株。RT-PCR和Western blot检测证实,Ccr2基因在该细胞系中成功表达,荧光显微镜下观察到该基因定位于细胞膜上,FCM显示90%以上的细胞膜上均有CCR2的表达。结论:构建了Ccr2真核表达载体并建立了稳定转染的RAW264.7细胞株。为进一步研究MCP1/CCR2信号通路在结核杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 趋化因子受体 真核表达 转染 RAW264.7细胞
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重组质粒pFLAG-CMV2-FcDDR2的构建及应用
6
作者 赵薇 张昭 +3 位作者 黄同列 穆楠 田菲 张伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1234-1237,共4页
目的构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-Fc DDR2),检测其自主磷酸化水平。方法设计Fc DDR2克隆引物,以质粒pSec Tag2B-Fc DDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的c DNA序列(Fc DDR2),将... 目的构建人盘状结构域受体2(DDR2)与IgG Fc段嵌合受体的重组质粒(pFLAG-CMV2-Fc DDR2),检测其自主磷酸化水平。方法设计Fc DDR2克隆引物,以质粒pSec Tag2B-Fc DDR2为模板,PCR扩增IgG Fc段与DDR2跨膜区和胞内区的c DNA序列(Fc DDR2),将其插入pFLAG-CMV2真核表达载体中。PCR扩增鉴定并测序验证重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2后,将其转染人胚肾HEK293T细胞,Western blot法验证HEK293T细胞中目标蛋白Fc DDR2的表达效率。将pcDNA3.1-DDR2转染HEK293T细胞,给予2型胶原蛋白刺激后作为阳性对照,用小鼠来源抗DDR2抗体免疫沉淀`pFLAG-CMV2-Fc DDR2阳性的HEK293T细胞及胶原刺激的pcDNA3.1-DDR2阳性的HEK293T细胞,4G10抗体分析DDR2的磷酸化水平,评价Fc DDR2的自主磷酸化能力。结果重组质粒pFLAG-CMV2-Fc DDR2的PCR扩增产物为大小约2800 bp左右的片段,与预期相符,测序验证正确。Western blot结果提示pFLAG-CMV2-Fc DDR2转染后的HEK293T细胞,FLAG-Fc DDR2表达水平显著上调。免疫沉淀结合Western blot分析提示FcDDR2的磷酸化水平与胶原刺激后的DDR2水平相当。结论成功构建了pFLAG-CMV2-FcDDR2真核表达载体,Fc DDR2的自主磷酸化与胶原蛋白刺激后DDR2的活化水平相当,可以用作DDR2经胶原蛋白刺激后的活化替代形式。 展开更多
关键词 重组质粒 FcDDR2 HEK293T细胞 胶原刺激 磷酸化
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银川市下呼吸道感染住院患儿中人鼻病毒的流行病学及临床特征分析 被引量：4
7
作者 黑志平 郭建辉 +4 位作者 季凯 闫琰 王春莉 李芳 孙玉宁 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1337-1343,共7页
目的:回顾性分析银川市下呼吸道感染患儿中人鼻病毒的流行病学及临床特征,为儿童预防人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)及临床诊疗提供理论依据。方法:采集2018至2019年因下呼吸道感染就诊于银川市妇幼保健院儿科的989例住院患儿的下呼吸... 目的:回顾性分析银川市下呼吸道感染患儿中人鼻病毒的流行病学及临床特征,为儿童预防人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)及临床诊疗提供理论依据。方法:采集2018至2019年因下呼吸道感染就诊于银川市妇幼保健院儿科的989例住院患儿的下呼吸道分泌物,采用多重PCR方法检测标本中病毒检出情况,分析人鼻病毒病例的基本情况、临床特征及实验室检查指标。结果:本研究989例下呼吸道感染患儿中,HRV总检出率为38.3%,HRV单纯感染率为9.5%,混合其他病毒感染率为28.9%;感染HRV的男患儿有221例(58.3%),女患儿有158例(41.7%);HRV感染常年都有发生,但主要流行在夏季和秋季;HRV感染患儿87.3%被诊断为肺炎,13.7%为支气管和毛细支气管炎;90.2%的感染患儿为小于6岁的儿童。HRV感染和非HRV感染患儿相比,HRV感染组发热和呕吐症状明显(P<0.05),而咳嗽、喘息、喘憋、闻及喘鸣音等临床特征方面没有统计学差异(P>0.05),在实验室检查指标分析中,血红蛋白、红细胞计数、谷草转氨酶、谷丙转氨酶以及乳酸酶含量均存在明显差异(P<0.05);结论:HRV是银川地区常见的下呼吸道感染病原体,6岁以下儿童极易感染,以发热为主要症状,且HRV感染会引发肺炎、支气管炎及毛细支气管炎下呼吸道感染疾病;HRV常与其他病毒混合感染;具有以夏、秋季为感染高峰的明显的季节性流行。 展开更多
关键词 人鼻病毒 下呼吸道感染 儿童 临床特点
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高糖对人晶状体上皮细胞沉默信号调节蛋白6(SIRT6)表达的影响 被引量：3
8
作者 蔡莲君 李欢 +5 位作者 徐丽珲 郭玉 芦晓红 罗明秀 张茜 姚青 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2020年第10期920-924,共5页
目的观察高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞(SRA01/04)活性及沉默信号调节蛋白6(SIRT6)表达的影响。方法将SRA01/04细胞在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol·L^-1、15.5 mmol·L^-1、25.5 mmol·L^-1、35.5 mmol·L^-1、45.5 mmol... 目的观察高浓度葡萄糖对人晶状体上皮细胞(SRA01/04)活性及沉默信号调节蛋白6(SIRT6)表达的影响。方法将SRA01/04细胞在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol·L^-1、15.5 mmol·L^-1、25.5 mmol·L^-1、35.5 mmol·L^-1、45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1)培养基中培养48 h后,用光镜观察SRA01/04细胞形态;CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性;Western blot检测各组细胞SIRT6蛋白的表达水平。然后将SRA01/04细胞用55.5 mmol·L^-1葡萄糖干预,培养不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)后,Western blot检测不同时间SRA01/04细胞SIRT6蛋白表达水平。免疫荧光技术检测对照组(5.5 mmol·L^-1葡萄糖)和高糖组(55.5 mmol·L^-1葡萄糖)细胞的SIRT6蛋白表达情况。结果随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的数量逐渐降低。CCK-8检测结果显示,与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组相比,随着葡萄糖浓度增加,SRA01/04细胞的活性逐渐降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,SRA01/04细胞的SIRT6蛋白表达与葡萄糖呈浓度和时间依赖性,45.5 mmol·L^-1、55.5 mmol·L^-1、75.5 mmol·L^-1葡萄糖组与5.5 mmol·L^-1葡萄糖组比较,以及24 h组、48 h组和72 h组与0 h组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示,SRA01/04细胞中的SIRT6蛋白主要在细胞核表达,高糖组SRA01/04细胞中SIRT6蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05),且高糖组细胞核出现明显的核固缩和核碎裂现象。结论高浓度葡萄糖可以降低SRA01/04细胞的增殖活性,降低SIRT6蛋白的表达水平。 展开更多
关键词 高浓度葡萄糖 晶状体上皮细胞 沉默信号调节蛋白6
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双重特异性磷酸酶15基因对吗啡敏化的调控作用
9
作者 张茜 王翌 +2 位作者 明智 朱永生 党伟 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期522-527,共6页
目的研究小鼠伏隔核(nucleus accumbens,NAc)中双重特异性磷酸酶15(dual-specificity phosphatase 15,DUSP15)在吗啡敏化中的作用。方法观察吗啡对小鼠自主活动及急性吗啡诱导小鼠活动的增强效应。采用Western blotting检测小鼠NAc中细... 目的研究小鼠伏隔核(nucleus accumbens,NAc)中双重特异性磷酸酶15(dual-specificity phosphatase 15,DUSP15)在吗啡敏化中的作用。方法观察吗啡对小鼠自主活动及急性吗啡诱导小鼠活动的增强效应。采用Western blotting检测小鼠NAc中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、p-ERK和DUSP15的表达。利用脑立体定位微量注射技术向小鼠NAc注射DUSP15过表达病毒(AAV-DUSP15),免疫荧光染色明确病毒表达。Western blotting检测AAV-DUSP15对DUSP15、ERK与p-ERK表达的影响;旷场实验评估小鼠自主活动情况。结果小鼠腹腔连续注射10 mg/kg吗啡7 d(连续注射1针/d),停药1周可诱导小鼠敏化行为。与盐水对照组相比,吗啡组小鼠ERK活化水平增高(p-ERK/ERK),DUSP15表达水平降低。与盐水对照组相比,向吗啡小鼠NAc注射AAV-DUSP15,DUSP15表达水平显著增高,ERK活化水平显著降低;小鼠活动距离及总活动距离显著降低。结论小鼠NAc中DUSP15通过负性调控ERK活化水平在吗啡敏化中起到关键调控作用,DUSP15激动剂对毒品成瘾具有潜在的治疗作用。 展开更多
关键词 双重特异性磷酸酶15(DUSP15) 细胞外调节蛋白激酶(ERK) 吗啡 敏化
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紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞活性和沉默信息调节因子6(SIRT6)表达的影响
10
作者 徐丽珲 郭玉 +4 位作者 伏等弟 蔡莲君 芦晓红 罗明秀 姚青 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2021年第9期817-821,共5页
目的探讨紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)活性和沉默信息调节因子6(SIRT6)表达的影响。方法将对数生长期的ARPE-19细胞按照照射剂量随机分为对照组(0 mJ·cm^(-2))及7.5 mJ·cm^(-2)、15.0 mJ·cm^(-2)、30.... 目的探讨紫外线照射对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)活性和沉默信息调节因子6(SIRT6)表达的影响。方法将对数生长期的ARPE-19细胞按照照射剂量随机分为对照组(0 mJ·cm^(-2))及7.5 mJ·cm^(-2)、15.0 mJ·cm^(-2)、30.0 mJ·cm^(-2)、60.0 mJ·cm^(-2)、120.0 mJ·cm^(-2)、240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组进行干预培养。照射后继续常规培养24 h,采用倒置荧光显微镜观察细胞形态并拍照,CCK-8法检测细胞存活率,Western blot检测各组细胞中SIRT6的表达情况,采用免疫荧光染色对对照组、30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组和240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6进行定位检测。结果对照组ARPE-19细胞呈梭形贴壁生长,边界清楚,连接紧密,细胞状态良好;30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组ARPE-19细胞形态不规整,细胞数量略有减少,细胞间连接疏松。CCK-8法检测结果显示与对照组相比,ARPE-19细胞在不同剂量紫外线照射后,细胞存活率显著降低且呈剂量依赖性(均为P<0.05)。与对照组相比,除较低照射剂量组(7.5 mJ·cm^(-2)、15.0 mJ·cm^(-2))外,其余各组SIRT6蛋白相对表达量均降低,且随着照射剂量的增加呈剂量依赖性逐渐降低(均为P<0.05)。经过30.0 mJ·cm^(-2)紫外线照射后,ARPE-19细胞随着再培养时间的延长,细胞中SIRT6蛋白的相对表达量逐渐下降(均为P<0.05)。对照组、30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组和240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组SIRT6主要表达于ARPE-19细胞核内;与对照组相比,30.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组和240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组ARPE-19细胞中SIRT6的荧光强度显著降低,且240.0 mJ·cm^(-2)照射剂量组降低更明显。结论紫外线照射能够降低ARPE-19细胞的增殖活性,同时也能下调细胞中SIRT6的表达。 展开更多
关键词 紫外线 人视网膜色素上皮细胞 沉默信息调节因子6
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