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嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞体外培养体系及慢病毒侵染条件的优化 被引量:1
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作者 王红霞 潘俊斐 +6 位作者 蒋丹 屈昱良 李艳宁 李光琪 楚元奎 张晓春 徐广贤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期390-397,共8页
目的优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件。方法CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细... 目的优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件。方法CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细胞介素2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-18、rhIL-7、rhIL-21、TWS119。分别于第0、3、5、7、10、18天进行细胞计数检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达,ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)释放,优化T细胞体外培养体系。采用(0、20、50)μg/mL重组人纤连蛋白(RetroNectin^■),(250、500、1000)ng/mL抗人CD3/CD28抗体包被培养板,以感染复数(MOI)=3、5的阴性对照慢病毒侵染T细胞72 h,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,初步判断病毒侵染效率;流式细胞术检测CD3/GFP阳性率,以获得慢病毒侵染条件。包装CD19 CAR慢病毒,实时荧光定量PCR、Western blot法检测是否成功构建CD19 CAR慢病毒载体,采用以上优化的病毒侵染条件及T细胞培养体系,包括建立rhIL-2、rhIL-12联合rhIL-18培养体系,使用1μg/mL抗人CD3/CD28,20μg/mLRetroNectin^■包被培养板,制备CD19 CAR-T细胞。结果细胞增殖能力较佳体系为rhIL-2联合rhIL-18,IFN-γ释放最强体系为rhIL-2、rhIL-12联合rhIL-18。抗CD3/CD28抗体剂量为1μg/mL,RetroNectin^■20μg/mL,MOI为3时病毒侵染效率最优。该优化条件下CAR-T细胞阳性率达34%。结论获得优化的CD19 CAR-T细胞体外培养体系及慢病毒侵染原代T细胞条件。 展开更多
关键词 增殖 活化 脐带血 嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞
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miR-142-3p靶向ATG4c调控RAW264.7巨噬细胞自噬 被引量:4
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作者 高倩 段相国 +3 位作者 李振昊 徐向荣 蒋丹 徐广贤 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1578-1582,1588,共6页
目的:研究miR-142-3p对自噬相关基因ATG4c的靶向调控作用,探究miR-142-3p影响RAW264.7细胞自噬途径的作用机制。方法:生物信息学软件分析miR-142-3p的靶基因为ATG4c,构建pMIR-Report-ATG4c和pMIR-Report-ATG4c mut重组质粒,双荧光素酶... 目的:研究miR-142-3p对自噬相关基因ATG4c的靶向调控作用,探究miR-142-3p影响RAW264.7细胞自噬途径的作用机制。方法:生物信息学软件分析miR-142-3p的靶基因为ATG4c,构建pMIR-Report-ATG4c和pMIR-Report-ATG4c mut重组质粒,双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot验证miR-142-3p与ATG4c的靶向作用;将做不同处理的RAW264.7细胞分为4组:正常细胞作为对照、50ng/ml雷帕霉素作用2h、EBSS饥饿作用12 h、10 nmol/L的3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12h后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-142-3p不同干预组中的相对表达情况;将miR-142-3p mimics、miR-142-3p inhibitor及miR-142-3p control分别转染到RAW264.7细胞中,检测miR-142-3p和LC3Ⅱ的相对表达。结果:双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western blot验证miR-142-3p通过靶向作用于ATG4c的3'-UTR抑制其表达;与对照组相比,雷帕霉素和饥饿处理的RAW264.7细胞miR-142-3p明显上调,而3-MA处理组miR-142-3p明显下调;与miR-142-3p control组相比,转染miR-142-3p mimics组中LC3Ⅱ蛋白表达显著下调,而miR-142-3p inhibitor组中表达显著上调。结论:miR-142-3p通过靶向调控自噬相关基因ATG4c,参与RAW264.7小鼠巨噬细胞自噬的调控。 展开更多
关键词 miR-142-3p 细胞自噬 ATG4c
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TGF-β1、Smad2及Smad3在脊柱结核诊疗中的价值 被引量:1
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作者 王辉 王立楠 +5 位作者 林剑文 郭乐 蒋丹 屈昱良 翟学峰 牛宁奎 《中国脊柱脊髓杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期56-66,共11页
目的:研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Smad2(drosophila mothers against decapentaplegic 2)及Smad3在脊柱结核诊断及疗效评价中的价值。方法:纳入2018年9月~2019年6月在宁夏医科大学总医院治疗的确诊... 目的:研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Smad2(drosophila mothers against decapentaplegic 2)及Smad3在脊柱结核诊断及疗效评价中的价值。方法:纳入2018年9月~2019年6月在宁夏医科大学总医院治疗的确诊为脊柱结核(观察组)和椎间盘退变(对照组)患者各35例,分析两组患者临床资料并收集椎间盘病变组织,同时收集观察组术前、术后6个月和术后1年(分别定义为A组、B组和C组)及对照组术前的外周血标本。提取椎间盘组织及外周血标本的RNA,荧光定量PCR法扩增TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA,免疫组化染色法检测其在椎间盘组织中的表达水平,ELISA法测定其在外周血中的蛋白表达水平。t检验分析各指标在组间及组内的表达差异;ROC曲线分析各指标单独及分别联合ESR、CRP诊断脊柱结核的价值;曲线回归分析各指标与脊柱结核患者临床资料的相关性。结果:在椎间盘mRNA水平,观察组TGF-β1、Smad2及Smad3表达高于对照组(P<0.05)。在椎间盘蛋白水平,观察组TGF-β1、Smad2及Smad3均为阳性表达,对照组均为阴性表达。在外周血mRNA水平,A组TGF-β1和Smad3表达高于对照组,B组表达低于A组(P<0.01),C组表达低于B组(P>0.05);Smad2表达水平在组间及组内比较时均为P>0.05。在外周血蛋白水平,A组TGF-β1表达高于对照组(P<0.01),B组表达低于A组(P<0.01),C组表达低于B组(P>0.05);Smad2和Smad3表达水平在组间及组内比较时均为P>0.05。ROC曲线显示外周血TGF-β1 mRNA、TGF-β1蛋白、Smad3 mRNA单独及分别联合ESR、CRP诊断脊柱结核的AUC分别是0.7800、0.8000、0.8352、0.8219、0.8705、0.8819、0.7410、0.7552、0.8000,敏感性分别是93.33%、73.33%、86.67%、70.00%、90.00%、80.00%、46.67%、46.67%、80.00%,特异性分别是54.29%、80.00%、80.00%、91.43%、88.57%、94.29%、100.00%、100.00%、85.71%(均为P<0.01)。曲线回归分析表明外周血TGF-β1和Smad3在mRNA水平表达呈显著正相关(R2=0.8534,P<0.01),外周血TGF-β1蛋白表达水平与脊柱结核患者的年龄、病程、病变椎体数量、ESR、CRP并无相关性。结论:TGF-β1/Smads信号通路与脊柱结核发病相关,其中TGF-β1/Smad3可能发挥主要作用;外周血及椎间盘组织TGF-β1、Smad3 mRNA检测可用于辅助脊柱结核诊断及疗效评价;外周血TGF-β1蛋白高表达,且与预后相关,可作为脊柱结核的诊断及疗效评价指标,与CRP联合诊断时价值更高。 展开更多
关键词 脊柱结核 转化生长因子Β1 SMAD2 SMAD3 诊断及疗效评价
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抗人CD20纳米抗体的筛选、表达及特性分析
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作者 李艳宁 李光琪 +4 位作者 王红霞 蒋丹 楚元奎 张爱君 徐广贤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期67-72,共6页
目的筛选出抗人CD20纳米抗体序列,并获得具有高亲和力与特异性的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体。方法利用天然噬菌体纳米抗体库,以生物素化的CD20抗原为靶标进行4轮液相亲和筛选,采用ELISA鉴定阳性克隆;将筛选到的阳性克隆基因序列与人IgG F... 目的筛选出抗人CD20纳米抗体序列,并获得具有高亲和力与特异性的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体。方法利用天然噬菌体纳米抗体库,以生物素化的CD20抗原为靶标进行4轮液相亲和筛选,采用ELISA鉴定阳性克隆;将筛选到的阳性克隆基因序列与人IgG Fc片段偶联,构建到原核表达载体pCZN1中,并转化至大肠杆菌Arctic Express,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导重组蛋白的表达,利用Ni柱进行亲和纯化;ELISA和Western blot法鉴定纯化产物。结果筛选得到了一条重复性高且亲水性好的CD20纳米抗体序列,纯化获得了纯度高达85%以上的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体。ELISA结果显示其与CD20抗原具有较高亲和力, Western blot结果表明该抗体能特异性识别CD20抗原。结论利用天然噬菌体纳米抗体库成功获得了抗CD20纳米抗体序列,经纯化的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体具有高亲和力与特异性。 展开更多
关键词 纳米抗体 CD20 噬菌体表面展示技术 原核表达
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