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突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的抗肿瘤血管活性 被引量：1
1
作者 魏枫 曹水 +4 位作者 任秀宝 刘虹 于津浦 付晓达 郝希山 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第4期322-327,共6页
目的:考察突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1,Stx1)真核表达载体抗肿瘤血管的活性。方法:使用流式细胞仪检测突变减毒Stx1真核表达载体转染对CHO细胞的影响;分别建立稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的CHO细胞株,使用... 目的:考察突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin 1,Stx1)真核表达载体抗肿瘤血管的活性。方法:使用流式细胞仪检测突变减毒Stx1真核表达载体转染对CHO细胞的影响;分别建立稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的CHO细胞株,使用这2个细胞株和对照细胞株的培养上清分别处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),观察其对HUVEC的增殖、迁移能力和形成管样结构能力的影响;使用人卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,观察突变减毒Stx1对肿瘤新生血管的作用。结果:突变减毒Stx1真核表达载体转染的CHO细胞未出现明显的凋亡或坏死改变;获得稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的基因工程细胞株,这些细胞株的培养上清与正常CHO细胞培养上清相比,能够在体外实验中抑制HUVEC的生长(P<0.05),且该作用可以被Stx1B亚基抗体阻断;突变减毒Stx1能够抑制HUVEC的迁移能力和管样结构形成能力;体内实验显示1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1真核表达载体治疗组与空载体对照组或生理盐水对照组相比,肿瘤微血管密度明显下降(P<0.01)。结论:成功建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株。证实突变减毒Stx1能够有效地抑制HUVEC的生长及正常功能的发挥。体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的血管生成。 展开更多
关键词 志贺样毒素Ⅰ 突变减毒 真核表达 内皮细胞 抗血管生成 卵巢肿瘤
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突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的构建及其抗卵巢癌的活性 被引量：3
2
作者 魏枫 任秀宝 +3 位作者 刘虹 于津浦 付晓达 郝希山 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2006年第6期435-441,共7页
目的构建表达突变减毒的志贺样毒素Ⅰ(Shiga-liketoxin1,Stx1)的真核表达载体,并考察其抗人卵巢癌细胞SKOV3的活性。方法重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/10和1/100的突变减毒Stx1编码序列,T-A克隆并测序后分别连入真核表达载体pcDNA3.... 目的构建表达突变减毒的志贺样毒素Ⅰ(Shiga-liketoxin1,Stx1)的真核表达载体,并考察其抗人卵巢癌细胞SKOV3的活性。方法重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/10和1/100的突变减毒Stx1编码序列,T-A克隆并测序后分别连入真核表达载体pcDNA3.1。转染SKOV3细胞,RT-PCR法检测Stx1mRNA在SKOV3细胞中的表达,观察突变减毒Stx1对SKOV3细胞周期的影响和致SKOV3细胞死亡的方式。使用SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,评价其体内抑瘤能力。结果突变减毒Stx1真核表达载体经酶切和测序鉴定与预期突变序列一致;RT-PCR证实转染后的SKOV3细胞中存在目的mRNA;体外实验观察到该载体转染可以使人卵巢癌SKOV3细胞的细胞周期阻滞于G2/M期,转染后SKOV3细胞死亡的主要途径是坏死;体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的生长。结论通过重叠PCR方法获得2种突变减毒Stx1编码序列,成功构建了相应的真核表达载体,并证实该载体具有明显的抗卵巢癌活性。 展开更多
关键词 志贺样毒素Ⅰ 突变 减毒 真核表达 卵巢癌
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携突变减毒Stx1编码序列重组腺病毒的构建及其抗乳腺癌的活性
3
作者 安秀梅 魏枫 +3 位作者 于津浦 李慧 杨莉莉 任秀宝 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期258-262,共5页
目的:构建携带1/100、1/1000减毒活性的突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin1,Stx1)编码序列的复制缺陷型腺病毒,并观察其抗人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的活性。方法:重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/100、1/1000的突变减毒Stx1编码序列,... 目的:构建携带1/100、1/1000减毒活性的突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Shiga-like toxin1,Stx1)编码序列的复制缺陷型腺病毒,并观察其抗人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的活性。方法:重叠PCR法构建毒性为原毒素毒性1/100、1/1000的突变减毒Stx1编码序列,T-A克隆并测序后构建携带该编码序列的复制缺陷型腺病毒载体Adv-Stx-1R170L。制备人乳腺癌T47D细胞移植瘤裸鼠模型,Adv-Stx-1R170L肿瘤局部注射给药,评价其体内抑瘤能力。结果:经测序证实正确克隆了1/100、1/1000减毒活性的突变减毒Stx1编码序列,成功构建携带该突变减毒Stx1编码序列的复制缺陷型腺病毒载体Adv-Stx-1R170L。体内实验显示,Adv-Stx-1R170L可以有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长,与携带绿色荧光蛋白编码序列的腺病毒对照组、PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了携带1/1000原毒素活性的突变减毒Stx1编码序列的重组复制缺陷型腺病毒载体,该病毒载体可以有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长,且未见明显毒性作用。 展开更多
关键词 志贺样毒素Ⅰ 突变减毒 乳腺癌 复制缺陷型腺病毒
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稳定表达sCD40L的CHO细胞系的建立和鉴定
4
作者 蒋华蔚 任秀宝 +2 位作者 于津浦 李慧 曹水 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第4期317-321,共5页
目的:建立稳定表达sCD40L的CHO细胞系。方法:从含sCD40L的载体pDC316-sCD40L中,将sCD40L编码序列克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP,获得重组质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,酶切及测序鉴定。电穿孔转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆,有限稀释法获取... 目的:建立稳定表达sCD40L的CHO细胞系。方法:从含sCD40L的载体pDC316-sCD40L中,将sCD40L编码序列克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP,获得重组质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,酶切及测序鉴定。电穿孔转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆后扩大培养。流式细胞术、倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;使用PCR、RT-PCR、ELISA方法分别从DNA、mRNA、蛋白水平对sCD40L的表达进行检测。Westernblotting检测CHO-sCD40L分泌的sCD40L与膜型CD40的结合;将CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共孵育24h后,流式细胞术检测MDA-MB-231细胞表面分子Fas的表达变化;加入Fas激活性抗体(CH-11)后观察MDA-MB-231细胞的凋亡。结果:成功构建质粒pIRES2-EGFP-sCD40L,转染CHO细胞后经克隆化培养获得稳定表达sCD40L的细胞系CHO-sCD40L。流式细胞术、倒置荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达高达90%以上;PCR检测证实sCD40L基因整合入细胞基因组DNA;RT-PCR检测到sCD40LmRNA的转录;ELISA法检测到细胞培养上清中有sCD40L蛋白表达,高达(4.5±2.1)ng/ml。Western blotting证实CHO-sCD40L分泌的sCD40L可与膜型CD40结合。CHO-sCD40L与MDA-MB-231细胞共培养后,MDA-MB-231细胞表面Fas表达由(3.0±1.02)%升高到(34.8±8.75)%;加入CH-1124h后,凋亡率由(5.4±1.32)%提高到(20.7±5.24)%(P<0.01)。结论:成功获得稳定表达sCD40L的CHO细胞系,为研究CD40/CD40L途径在肿瘤免疫治疗中的应用提供了有用的工具。 展开更多
关键词 可溶性CD40配体 CHO细胞 绿色荧光蛋白 凋亡 FAS
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