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华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的功能鉴定
被引量：
5
1
作者
徐劲
郑南才
+4 位作者
吴忠道
陈守义
胡旭初
应康
余新炳
《中国人兽共患病杂志》
CSCD
北大核心
2005年第10期863-866,共4页
目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目...
目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目的片段,与表达质粒pGEX-4T-1连接构建重组质粒,IPTG诱导表达;研究重组蛋白的理化性质及酶动力学特征,并寻找可能的抑制剂。结果成功表达出约64 kDa的重组蛋白,凝血酶切后为36 kDa蛋白,其酶活性为63.6U/mg。1.14 mM 4,4′-二甲氨基联苯甲醇处理30 min酶活性下降了60%;吡喹酮、灭滴灵和阿苯哒唑对酶活性无抑制作用;而5’-单磷酸腺苷对重组酶有竞争性抑制作用,其Ki为0.49。结论成功地表达了目的蛋白,为药物筛选提供了一个易于获得的候选蛋白分子。
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关键词
华支睾吸虫
线粒体苹果酸脱氢酶
异源表达
酶动力学参数
抑制
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职称材料
华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性位点氨基酸点突变对酶活性和热稳定性影响
被引量：
4
2
作者
郑南才
黄宝明
+4 位作者
徐劲
黄善盛
胡旭初
陈金中
余新炳
《中国人兽共患病学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第6期575-579,共5页
目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质...
目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质粒,转染大肠杆菌后表达蛋白,测定酶活性和圆二色性,测定不同温度时222nm圆二色性改变,确定不同点突变蛋白的热稳定性。结果H195被异亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸置换后,酶活性下降了100倍以上,但随着H195被不同氨基酸置换和H195周围氨基酸被置换情况的不同,不同突变株表达的蛋白酶活性差别很大,H195/I195和H195/Y195突变株表达的蛋白酶活性明显高于H195N197/I195Y197和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白酶活性;H195/Y195突变株表达的蛋白与未突变蛋白的二级结构差异明显;H195/Y195和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白热稳定性明显降低,tm值分别为63.5℃和64℃,比Cs cMDH的tm值分别下降了4℃和3.5℃。结论活性中心H195的点突变可导致华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性的明显下降,而且H195被不同的氨基酸置换后可导致酶活性下降程度的不同,H195周围氨基酸被替换成具有形成氢键或二硫键的氨基酸后,导致酶活性下降更为明显;H195及其周围氨基酸的突变可导致蛋白质二级结构的改变和热稳定性的不同程度下降。
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关键词
华支睾吸虫
胞浆苹果酸脱氢酶
点突变
圆二色性
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职称材料
题名
华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的功能鉴定
被引量：
5
1
作者
徐劲
郑南才
吴忠道
陈守义
胡旭初
应康
余新炳
机构
中山
大学
基础医
学院
病原生物学教研室
复旦大学生命科学院遗传研究所基因工程国家重点实验室
出处
《中国人兽共患病杂志》
CSCD
北大核心
2005年第10期863-866,共4页
基金
广东省自然科学基金重点项目(NO.036627)
广东省科技计划项目重大专项(NO.2004A300801004)
文摘
目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目的片段,与表达质粒pGEX-4T-1连接构建重组质粒,IPTG诱导表达;研究重组蛋白的理化性质及酶动力学特征,并寻找可能的抑制剂。结果成功表达出约64 kDa的重组蛋白,凝血酶切后为36 kDa蛋白,其酶活性为63.6U/mg。1.14 mM 4,4′-二甲氨基联苯甲醇处理30 min酶活性下降了60%;吡喹酮、灭滴灵和阿苯哒唑对酶活性无抑制作用;而5’-单磷酸腺苷对重组酶有竞争性抑制作用,其Ki为0.49。结论成功地表达了目的蛋白,为药物筛选提供了一个易于获得的候选蛋白分子。
关键词
华支睾吸虫
线粒体苹果酸脱氢酶
异源表达
酶动力学参数
抑制
Keywords
Clonorchis sinensis
mitochondrial malate dehydrogenase
heterologous expression
kinetic parameters
inhibition
分类号
R383.2 [医药卫生—医学寄生虫学]
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职称材料
题名
华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性位点氨基酸点突变对酶活性和热稳定性影响
被引量：
4
2
作者
郑南才
黄宝明
徐劲
黄善盛
胡旭初
陈金中
余新炳
机构
江门市疾病预防控制中心
中山
大学
基础医
学院
病原生物学教研室
复旦大学生命科学院遗传研究所基因工程国家重点实验室
出处
《中国人兽共患病学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第6期575-579,共5页
基金
广东省自然科学基金重点项目(NO.036627)
广东省科技计划项目重大专项(NO.2004A300801004)
文摘
目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质粒,转染大肠杆菌后表达蛋白,测定酶活性和圆二色性,测定不同温度时222nm圆二色性改变,确定不同点突变蛋白的热稳定性。结果H195被异亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸置换后,酶活性下降了100倍以上,但随着H195被不同氨基酸置换和H195周围氨基酸被置换情况的不同,不同突变株表达的蛋白酶活性差别很大,H195/I195和H195/Y195突变株表达的蛋白酶活性明显高于H195N197/I195Y197和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白酶活性;H195/Y195突变株表达的蛋白与未突变蛋白的二级结构差异明显;H195/Y195和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白热稳定性明显降低,tm值分别为63.5℃和64℃,比Cs cMDH的tm值分别下降了4℃和3.5℃。结论活性中心H195的点突变可导致华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性的明显下降,而且H195被不同的氨基酸置换后可导致酶活性下降程度的不同,H195周围氨基酸被替换成具有形成氢键或二硫键的氨基酸后,导致酶活性下降更为明显;H195及其周围氨基酸的突变可导致蛋白质二级结构的改变和热稳定性的不同程度下降。
关键词
华支睾吸虫
胞浆苹果酸脱氢酶
点突变
圆二色性
Keywords
Clonorchis sinensis
cytosolie malate dehydrogenase
site-- mutagenesis
cicular dichroism
分类号
R383.2 [医药卫生—医学寄生虫学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的功能鉴定
徐劲
郑南才
吴忠道
陈守义
胡旭初
应康
余新炳
《中国人兽共患病杂志》
CSCD
北大核心
2005
5
在线阅读
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职称材料
2
华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性位点氨基酸点突变对酶活性和热稳定性影响
郑南才
黄宝明
徐劲
黄善盛
胡旭初
陈金中
余新炳
《中国人兽共患病学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006
4
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