为研究鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)对细胞增殖、细胞凋亡的调控及其可能的分子机制,以pcDNA3.1 in NIH3T3阴性对照细胞株和过表达prosaposin的Psap-Myc in NIH3T3细胞株为模型,噻唑蓝(MTT)比色法检测prosaposin对细胞增殖的影响;Annexi...为研究鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)对细胞增殖、细胞凋亡的调控及其可能的分子机制,以pcDNA3.1 in NIH3T3阴性对照细胞株和过表达prosaposin的Psap-Myc in NIH3T3细胞株为模型,噻唑蓝(MTT)比色法检测prosaposin对细胞增殖的影响;Annexin V联合碘化丙啶(Propidium iodide,PI)法检测血清饥饿状态下prosaposin对细胞凋亡的影响;Western blotting检测PI3K/Akt信号通路中蛋白磷酸化水平的变化;Real-time PCR检测PI3K/Akt信号通路下游靶分子表达水平的改变。结果表明prosaposin可活化PI3K/Akt信号通路,提高AktSer473的磷酸化水平,抑制细胞周期抑制基因P27KIP1的表达,上调细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,促进细胞周期从G1→S期进展;诱导survival基因cIAP1、cIAP2的表达,促进细胞存活。这些结果提示,prosaposin对细胞增殖和凋亡的调控可能是通过PI3K/Akt信号通路及其下游靶分子进行的。展开更多
Mdfic(MyoD family inhibitor domain containing)是一个新发现的含有MyoD抑制素结构域(I-mfa domain)的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中发挥重要作用.小鼠Rhox5为同源异型框基因,隶属于Rhox基因簇(reproductive homeobox on the...Mdfic(MyoD family inhibitor domain containing)是一个新发现的含有MyoD抑制素结构域(I-mfa domain)的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中发挥重要作用.小鼠Rhox5为同源异型框基因,隶属于Rhox基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome genes cluster)β亚簇.在前期证实Mdifc能结合Rhox5蛋白的基础上,进一步鉴定两者相互作用的关键结构域.生物信息学分析Mdfic的氨基酸序列,PCR方法扩增Mdfic A截短型片段(第72～247位氨基酸残基),含保守的I-mfa结构域;双向酵母双杂交和体外GST-Pull down结果表明,该截短型片段可以与Rhox5蛋白结合,且结合力度较完整的Mdfic蛋白强;将Mdfic A片段划分为两段:Mdfic B(72～191 aa,不含I-mfa结构域)和Mdfic C(191～247 aa,含I-mfa结构域).结果表明,含保守I-mfa结构域的Mdfic C截短型片段丧失了与Rhox5蛋白结合的能力,而不含I-mfa结构域的Mdfic B截短型片段可以结合Rhox5蛋白.鉴于Mdfic蛋白的非I-mfa结构域在Rhox5/Mdfic结合中发挥关键作用,Rhox5与Mdfic的结合可能进一步调控由Mdfic的I-mfa结构域参与的其他转录因子(如MyoD)的调控,三者形成一个复杂的调控网络,共同参与肌细胞发生及分化的调控.展开更多
文摘为研究鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)对细胞增殖、细胞凋亡的调控及其可能的分子机制,以pcDNA3.1 in NIH3T3阴性对照细胞株和过表达prosaposin的Psap-Myc in NIH3T3细胞株为模型,噻唑蓝(MTT)比色法检测prosaposin对细胞增殖的影响;Annexin V联合碘化丙啶(Propidium iodide,PI)法检测血清饥饿状态下prosaposin对细胞凋亡的影响;Western blotting检测PI3K/Akt信号通路中蛋白磷酸化水平的变化;Real-time PCR检测PI3K/Akt信号通路下游靶分子表达水平的改变。结果表明prosaposin可活化PI3K/Akt信号通路,提高AktSer473的磷酸化水平,抑制细胞周期抑制基因P27KIP1的表达,上调细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,促进细胞周期从G1→S期进展;诱导survival基因cIAP1、cIAP2的表达,促进细胞存活。这些结果提示,prosaposin对细胞增殖和凋亡的调控可能是通过PI3K/Akt信号通路及其下游靶分子进行的。
