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用于非洲猪瘟病毒多靶标核酸检测的DNA假病毒制备及定量
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作者 邓俊花 李昊轩 +6 位作者 陈冬杰 吕继洲 王晶晶 张舟 袁向芬 魏方 吴绍强 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3555-3560,共6页
本研究旨在研制一种全程质控非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测、避免质粒交叉污染的DNA假病毒。将ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L 4种检测关键基因及EGFP基因共构建于杆状病毒的转移载体pFastBac^(TM)Dual中,转化形成重组Bacmid pFast... 本研究旨在研制一种全程质控非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸检测、避免质粒交叉污染的DNA假病毒。将ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L 4种检测关键基因及EGFP基因共构建于杆状病毒的转移载体pFastBac^(TM)Dual中,转化形成重组Bacmid pFastBac-EGFP-ASFV,转染至sf21细胞,包装产生ASFV重组杆状病毒。结果显示:通过荧光倒置显微镜观察,表达的EGFP蛋白绿色荧光信号指示成功获取AcMNPV-EGFP-ASFV病毒;重组杆状病毒基因组溯源分析,ASFV B646L/CD2v/MGF505-1R/MGF360-12L基因序列满足现行检测方法质控需求;ASFV质控品均匀、稳定,-20℃保存至少可稳定24个月。采用ddPCR定量为4.09×10^(3) copies·μL^(-1)。本研究非洲猪瘟病毒DNA假病毒的制备,为非洲猪瘟疫情监测提供了新的技术支撑。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 DNA假病毒 定量
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黄颡鱼实时荧光RPA及侧向流RPA试纸条快速现场鉴定方法的建立与应用
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作者 林玉 张旻 +11 位作者 王娜 何舜平 张辉 唐永凯 方成池 景宏丽 张浪 沙航 段志强 王宽 吕继洲 吴绍强 《水生生物学报》 北大核心 2025年第4期120-128,共9页
研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,... 研究以黄颡鱼为目标对象,基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等温扩增技术,开发了实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条两种现场快速检测方法。这些方法能够用于快速、准确和灵敏地实时检测出黄颡鱼DNA。首先,通过对黄颡鱼及其近缘物种的鱼类线粒体基因组序列进行对比分析,针对COI基因保守区域,设计了特异性探针和引物。测试结果显示,在37℃条件下,实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条都具有良好的特异性。实时荧光型RPA方法能够在20min内完成黄颡鱼DNA的检测,且最低检测限可以达到102拷贝数/反应;而侧向流RPA试纸条的操作更加便捷,能够在10min内可完成对102低拷贝数的黄颡鱼DNA的扩增和鉴定。应用这两种RPA检测技术对149份长江流域常见鱼类进行现场检测,两种方法均显示出较高的准确性(准确率100%)。因此,研究开发的两种用于检测黄颡鱼的实时荧光型RPA和侧向流RPA试纸条方法,拥有操作简便、结果直观、准确率高、不依赖实验室仪器设备等优势,具有良好的现场快速检测应用前景。此外,其克服了形态学物种鉴定专业门槛高、难以鉴定残破组织样品的问题,检测靶标可跨越卵、鱼苗、成鱼等全生命周期,为水产品监管执法提供技术手段。 展开更多
关键词 快速物种鉴定 重组酶聚合酶扩增 实时荧光型RPA 侧向流RPA试纸条 黄颡鱼
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赤羽病病毒N蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立及应用 被引量：4
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作者 陈冬杰 魏方 +3 位作者 李昊轩 王晶晶 许晓琳 吴绍强 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期57-62,共6页
本研究旨在建立一种赤羽病病毒(AKAV)N蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的AKAV N重组蛋白作为包被抗原,HRP标记的单克隆抗体(mAb)1C5作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于AKAV N蛋白的AKAV阻断ELISA抗体检测方法。用建立... 本研究旨在建立一种赤羽病病毒(AKAV)N蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的AKAV N重组蛋白作为包被抗原,HRP标记的单克隆抗体(mAb)1C5作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于AKAV N蛋白的AKAV阻断ELISA抗体检测方法。用建立的阻断ELISA方法检测67份临床阴性血清,计算血清阻断率PI并确定了临界值及判定标准:当PI>53.1%时判定为AKAV抗体阳性;PI<46.8%时判定为AKAV抗体阴性;当PI介于两者之间时,判定为可疑。该方法与牛病毒性腹泻病毒、牛结节性皮肤病病毒和蓝舌病毒的抗体阳性血清无交叉反应。用该方法与商品化ID screen AKAV抗体检测试剂盒同时检测79份牛临床血清样品,两种方法的符合率为91.1%。本实验室建立的AKAV阻断ELISA抗体检测方法可用于国内临床中AKAV血清抗体的检测,对AKAV的临床诊断具有非常重要的参考意义。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 单克隆抗体 阻断ELISA 蛋白表达
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