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西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、时空表达谱及抗体制备
被引量：
6
1
作者
叶亚萍
刘治滩
+7 位作者
李琪明
臧贺
冯佩林
王宁
王杰
黄枳腱
陈大福
郭睿
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第1期18-28,共11页
【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本...
【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。【方法】PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C4624H7332N1316O1325S51,分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的氨基酸序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。【结论】AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。
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关键词
西方蜜蜂
AmAGO1
克隆
分子特性
时空表达谱
原核表达
多克隆抗体
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职称材料
东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-26675及其靶基因NcSec24的研究
2
作者
赵萧
荆欣
+5 位作者
冯佩林
张艺琼
任亚萍
姚雨彤
黄枳腱
郭睿
《福建农林大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第5期662-670,共9页
【目的】探明nce-miR-26675通过靶向调控蛋白转运体NcSec24基因的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程,为其侵染意大利蜜蜂工蜂的机制提供依据。【方法】联用RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-26675的靶基...
【目的】探明nce-miR-26675通过靶向调控蛋白转运体NcSec24基因的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程,为其侵染意大利蜜蜂工蜂的机制提供依据。【方法】联用RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-26675的靶基因,取交集作为靶基因集合。使用Blast工具将靶基因比对到基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库以获得相应的功能和通路注释。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-26675和NcSec24的表达谱。利用Expasy网站上的相关软件预测和分析NcSec24的理化性质和分子特性。分别使用MEME和TBtools软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种NcSec24蛋白的保守基序和结构域。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的NcSec24蛋白进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建了基于NcSec24蛋白的系统进化树。【结果】nce-miR-26675靶向NcSec24等13个基因,其中,10个靶基因可注释到GO中的37个功能条目,6个基因注释KEGG中的23条KEGG通路。与接种后1 d相比,nce-miR-26675的表达量在接种后2 d显著上调(P<0.05),在接种后3、4 d显著下调(P<0.05),呈现先上升再下降的趋势;NcSec24的表达量在接种后2、3、4 d均显著下调(P<0.05),表现出持续下降的趋势。NcSec24的分子质量约为80.419 ku,等电点为5.60,分子式为C3671H5653N897O1067S31,平均亲水系数为-0.035;NcSec24不含典型信号肽,可同时定位于细胞核和细胞质;NcSec24含4个结构域(Sec23_trunk、Sec23_helical、zf-Sec23_Sec24和Sec23_BS)与5个保守基序(motif1、motif2、motif3、motif4和motif5);东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫、泰氏康罗汉孢虫的NcSec24聚为一支。【结论】nce-miR-26675通过靶向调控NcSec24的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程。NcSec24是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫和泰氏康罗汉孢虫的Nc-Sec24同源性较高。
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关键词
蜜蜂
西方蜜蜂
东方蜜蜂微孢子虫
微小RNA
靶基因
调控网络
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职称材料
题名
西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、时空表达谱及抗体制备
被引量：
6
1
作者
叶亚萍
刘治滩
李琪明
臧贺
冯佩林
王宁
王杰
黄枳腱
陈大福
郭睿
机构
福建农林大学蜂学与生物医药学院
天然生物毒素国家地方联合工程实验室
福建省蜂疗研究所
四川省农业农村厅畜牧总站
出处
《昆虫学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第1期18-28,共11页
基金
国家自然科学基金青年项目(32372943,31702190)
国家现代农业产业技术体系专项资助基金项目(CARS-44-KXJ7)
+3 种基金
福建省自然科学基金面上项目(2022J01131334)
福建农林大学硕士生导师团队项目(郭睿)
福建农林大学科技创新专项基金项目(KFb22060XA)
福建省大学生创新创业训练计划项目(202310389023,202310389029)。
文摘
【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。【方法】PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C4624H7332N1316O1325S51,分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的氨基酸序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。【结论】AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。
关键词
西方蜜蜂
AmAGO1
克隆
分子特性
时空表达谱
原核表达
多克隆抗体
Keywords
Apis mellifera
AmAGO1
cloning
molecular properties
spatio-temporal expression profile
prokaryotic expression
polyclonal antibody
分类号
S891 [农业科学—特种经济动物饲养]
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职称材料
题名
东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-26675及其靶基因NcSec24的研究
2
作者
赵萧
荆欣
冯佩林
张艺琼
任亚萍
姚雨彤
黄枳腱
郭睿
机构
福建农林大学蜂学与生物医药学院
四川省农业农村厅畜牧总站
福建省蜂疗研究所
出处
《福建农林大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第5期662-670,共9页
基金
国家自然科学基金项目(32172792)
国家现代农业产业技术体系专项资金项目(CARS-44-KXJ7)
+4 种基金
福建省自然科学基金项目(2022J01131334)
福建农林大学硕士生导师团队项目(郭睿)
福建农林大学科技创新专项(KFb22060XA)
福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)科研扶持项目
福建省大学生创新创业训练计划项目(202310389028､X202310389084)。
文摘
【目的】探明nce-miR-26675通过靶向调控蛋白转运体NcSec24基因的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程,为其侵染意大利蜜蜂工蜂的机制提供依据。【方法】联用RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-26675的靶基因,取交集作为靶基因集合。使用Blast工具将靶基因比对到基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库以获得相应的功能和通路注释。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-26675和NcSec24的表达谱。利用Expasy网站上的相关软件预测和分析NcSec24的理化性质和分子特性。分别使用MEME和TBtools软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种NcSec24蛋白的保守基序和结构域。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的NcSec24蛋白进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建了基于NcSec24蛋白的系统进化树。【结果】nce-miR-26675靶向NcSec24等13个基因,其中,10个靶基因可注释到GO中的37个功能条目,6个基因注释KEGG中的23条KEGG通路。与接种后1 d相比,nce-miR-26675的表达量在接种后2 d显著上调(P<0.05),在接种后3、4 d显著下调(P<0.05),呈现先上升再下降的趋势;NcSec24的表达量在接种后2、3、4 d均显著下调(P<0.05),表现出持续下降的趋势。NcSec24的分子质量约为80.419 ku,等电点为5.60,分子式为C3671H5653N897O1067S31,平均亲水系数为-0.035;NcSec24不含典型信号肽,可同时定位于细胞核和细胞质;NcSec24含4个结构域(Sec23_trunk、Sec23_helical、zf-Sec23_Sec24和Sec23_BS)与5个保守基序(motif1、motif2、motif3、motif4和motif5);东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫、泰氏康罗汉孢虫的NcSec24聚为一支。【结论】nce-miR-26675通过靶向调控NcSec24的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程。NcSec24是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白,东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫和泰氏康罗汉孢虫的Nc-Sec24同源性较高。
关键词
蜜蜂
西方蜜蜂
东方蜜蜂微孢子虫
微小RNA
靶基因
调控网络
Keywords
honeybee
Apis mellifera
Nosema ceranae
microRNA
target gene
regulation network
分类号
S895 [农业科学—特种经济动物饲养]
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西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、时空表达谱及抗体制备
叶亚萍
刘治滩
李琪明
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东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-26675及其靶基因NcSec24的研究
赵萧
荆欣
冯佩林
张艺琼
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姚雨彤
黄枳腱
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《福建农林大学学报（自然科学版）》
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