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题名突变k-ras基因重组腺病毒的构建
被引量：7
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作者
赵峰
周清华
覃扬
孙芝琳
孙泽芳
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机构
四川大学华西医院(原华西医科大学附属第一医院)胸心外科
四川大学华西医学中心(原华西医科大学附属第一医院)基础医学院
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出处
《中国肺癌杂志》
CAS
2002年第1期14-17,共4页
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基金
国家自然科学基金 ( 30 0 0 0 2 0 6 )
教育部博士点基金 ( 2 0 0 0 55)资助
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文摘
目的 利用细菌内同源重组法构建含 1 2密码子点突变的k ras基因重组腺病毒。方法 用限制性内切酶kpnⅠ +xhoⅠ从载体pcDNA3 k ras1 2 (Val)中切出 1 2密码子点突变的k ras基因片断 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val) ,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因重组质粒pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒 ,PacⅠ酶切后用脂质体转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒Ad k ras1 2 (Val)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,利用穿梭质粒pAdTrack CMV中带有GFP报告基因 ,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果 利用CaCl2 法由pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val)和pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,可获得 2 5%左右的阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因 ,滴度为 1 .2× 1 0 1 2 pfu/ml。结论 细菌内同源重组法构建腺病毒相比于传统的细胞内同源重组法 ,具有成功率高、方法简便、快捷、实验周期短的优点 。
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关键词
腺病毒
突变ras基因
同源重组
肿瘤免疫治疗
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Keywords
Adenovirus vector Mutant k ras Homologous recombinant Bacteria
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分类号
R73-36
[医药卫生—肿瘤]
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