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两种色型黄粉虫酚氧化酶原的cDNA克隆、生物信息学分析及表达水平检测 被引量：3
1
作者 黄琼 胡杰 王勤 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期594-604,共11页
酚氧化酶是黑色素合成和昆虫免疫的关键酶,通常以无活性的酚氧化酶原形式存在。为给黄粉虫Tenebrio molitor遗传分化和免疫防御研究提供参考,本研究采用PCR和RACE技术克隆了黄、黑两种色型黄粉虫幼虫的酚氧化酶原基因Tm-ppo,对其cDNA序... 酚氧化酶是黑色素合成和昆虫免疫的关键酶,通常以无活性的酚氧化酶原形式存在。为给黄粉虫Tenebrio molitor遗传分化和免疫防御研究提供参考,本研究采用PCR和RACE技术克隆了黄、黑两种色型黄粉虫幼虫的酚氧化酶原基因Tm-ppo,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测其在两种色型黄粉虫不同发育阶段mRNA表达水平上的动态变化。结果表明:从黄、黑两种色型黄粉虫幼虫中克隆出的两个Tm-ppocDNA序列全长均为2199bp,碱基序列一致性为99%,包含一个2055bp的开放阅读框,编码684个氨基酸,它们的编码蛋白有3个氨基酸差异:第176位(P→A)、256位(V→A)和648位(I→M)。这两个基因分别被命名为Tm-ppo-1和Tm-ppo-2(GenBank登录号分别为JX987235和JX987234)。Tm-ppo-1和Tm-ppo-2编码的酚氧化酶原异构体蛋白(分别为Tm-PPO-1和Tm-PPO-2)存在一个可能的酚氧化酶原水解活化位点(R50～F51残基之间)和一个双铜结合中心(第196～239位残基和第344～411位残基);同时含有一个类似巯基酯区域的序列(第579～588位残基)及一个C-末端保守基序(第634～645位残基);但它们无氨基端疏水信号肽序列,也不存在跨膜区域。Tm-PPO-1和Tm-PPO-2的二级结构由大量的α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成;三级结构分为前导域(第16～66位残基)、不相邻的功能域Ⅰ(第3～15位残基和第67～181位残基)、功能域Ⅱ(第182～419位残基)和功能域Ⅲ(第420～679位残基)4部分。此外,Tm-ppo-1和Tm-ppo-2在黄、黑两种色型黄粉虫的各发育期均有表达,并且不同发育阶段的mRNA表达水平呈现明显的变化规律:幼虫期﹥成虫期﹥蛹期。同时,环境温度对Tm-ppo-1和Tm-ppo-2的mRNA表达具有显著影响:与常温对照组(25～30℃)相比,42℃暴露24h和48h的两种色型黄粉虫幼虫、蛹和成虫的mRNA表达量明显下调。相同试验条件下,黑色型黄粉虫幼虫和成虫的Tm-ppo-2mRNA表达量明显高于黄色型幼虫和成虫的Tm-ppo-1mRNA表达量,但两种色型黄粉虫蛹的Tm-ppo异构体表达量无显著差异。本研究为进一步探讨黄粉虫的遗传分化和免疫防御提供了有益参考。 展开更多
关键词 黄粉虫 色型 酚氧化酶原 基因异构体 生物信息学 MRNA表达
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黄粉虫热休克蛋白70基因的克隆、序列分析与表达(英文) 被引量：5
2
作者 黄琼 胡杰 +1 位作者 孙灵 王勤 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期475-485,共11页
为给黄粉虫Tenebriomolitor抗逆机理研究提供理论依据,本研究采用PCR和RACE法从黄粉虫幼虫中克隆出一个热休克蛋白70基因Tmhsp70,并运用半定量RT-PCR法检测其在黄粉虫不同发育阶段的mRNA表达水平。结果表明:克隆出的Tmhsp70序列全长2282... 为给黄粉虫Tenebriomolitor抗逆机理研究提供理论依据,本研究采用PCR和RACE法从黄粉虫幼虫中克隆出一个热休克蛋白70基因Tmhsp70,并运用半定量RT-PCR法检测其在黄粉虫不同发育阶段的mRNA表达水平。结果表明:克隆出的Tmhsp70序列全长2282bp,具有一个富含A的115bp5'-非翻译区和一个1935bp的开放阅读框及一个富含A、T的232bp3'-非翻译区。5'-非翻译区含有7个热休克元件nGAAn,3'-非翻译区末端有长22bp的Poly(A)尾。Tmhsp70编码的黄粉虫热休克蛋白(TmHSP70)具有3个典型的HSP70特征基序(IDLGTTYS,IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQQ)和1个胞质HSP70末端特征基序(EEVD),无信号肽和跨膜区域,包含2个主要的结构域,即:N-端42kDa的高度保守ATPase功能域和C-端18kDa的保守多肽结合功能域。ATPase功能域的三级结构由2个大球形亚功能域组成,具有1个核苷酸结合中心;多肽结合功能域形成1个双层4股β-折叠片样的三明治结构和2个α-螺旋,内含1个多肽结合通道。此外,黄粉虫Tmhsp70mRNA的表达具有热激诱导和发育调控的特征。半定量RT-PCR分析表明,42℃热激1h的黄粉虫各发育阶段Tmhsp70mRNA的表达量上升了1.4～26.9倍。25℃下1日龄黄粉虫蛹中的Tmhsp70mRNA表达量要高于其余各发育阶段的累积表达量;42℃热激1h后90日龄幼虫中的Tmhsp70mRNA表达量最丰富,既高于30日龄和60日龄幼虫中的累积表达量,也高于15日龄和30日龄成虫中的累积表达量。这些结果为进一步研究黄粉虫热休克蛋白的结构、功能和表达调控及其与抗逆性的关系奠定了基础。 展开更多
关键词 黄粉虫 热休克蛋白 基因克隆 生物信息学 MRNA表达 热激
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2种色型黄粉虫酯酶同工酶的比较 被引量：1
3
作者 黄琼 胡杰 苟琳 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期610-616,共7页
采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳并结合分光光度法,对黄、黑2种色型黄粉虫(Tenebrio molitor L.)各发育期的酯酶同工酶酶谱及酶活性进行比较研究.结果表明:在2种色型黄粉虫的各发育期,共发现迁移率不同的酯酶同工酶酶带15条,这些酶... 采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳并结合分光光度法,对黄、黑2种色型黄粉虫(Tenebrio molitor L.)各发育期的酯酶同工酶酶谱及酶活性进行比较研究.结果表明:在2种色型黄粉虫的各发育期,共发现迁移率不同的酯酶同工酶酶带15条,这些酶带分布于5个不同的泳动区;黑色型的幼虫和成虫分别比黄色型的幼虫和成虫各多1条特征性酶带;同一色型黄粉虫各发育期酯酶同工酶的酶带数、酶活性强弱及迁移率也变化较大,卵期的酶带数最少(4条)、最弱,其中2条为卵期的特有性酶带.酶活性检测进一步表明:从卵至成虫期,黑色型黄粉虫的羧酸酯酶(CarE)、乙酰胆碱酯酶(AchE)和磷酸酯酶(ACP和AKP)活性均比黄色型黄粉虫高;同一色型黄粉虫各发育阶段的CarE、AchE及ACP和AKP活性也呈现明显的规律性变化,即:卵期<成虫期<蛹期<幼虫期.上述结果为黄粉虫的抗药性研究及品种选育积累了一定的基础数据. 展开更多
关键词 黄粉虫 黄色型 黑色型 酯酶同工酶 酶谱 酶活性
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