猪传染性胸膜肺炎疫苗应用现状及研究进展

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作者 邓谊 陈嘉勇 +10 位作者 王榆菡 刘佳乐 左昌雄 彭稚凌 卢坤 王瑀珞 陈玺竹 温鑫 王丹 曹三杰 赵勤 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第3期762-770,共9页

【目的】了解猪传染性胸膜肺炎疫苗的应用现状及研究进展,以期为猪传染性胸膜肺炎安全、高效且交叉保护效果良好的新型疫苗的研发提供参考,为该病的预防和控制提供一定的理论依据。【方法】通过查阅近年来国内外相关文献及进行市场调研... 【目的】了解猪传染性胸膜肺炎疫苗的应用现状及研究进展,以期为猪传染性胸膜肺炎安全、高效且交叉保护效果良好的新型疫苗的研发提供参考,为该病的预防和控制提供一定的理论依据。【方法】通过查阅近年来国内外相关文献及进行市场调研,对国内外猪传染性胸膜肺炎各类疫苗的应用现状及最新研究进展进行了全面的总结和分析。【结果】临床上所用的猪传染胸膜肺炎疫苗种类较多,但各有优缺点;国内外都开展了对猪传染胸膜肺炎各类新型疫苗的研发,但目前应用落地的新型疫苗还比较少。【结论】应聚焦于多联多价、新型高效、质优价廉的新型猪传染性胸膜肺炎疫苗的开发及应用。 展开更多

关键词 猪传染性胸膜肺炎 胸膜肺炎放线杆菌 疫苗 预防接种

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四川主要养猪地区猪2型链球菌血清流行病学调查 被引量：7

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作者 徐魁 王巍 +5 位作者 文心田 黄小波 伍锐 文翼平 赵勤 曹三杰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期370-373,共4页

为了解近年来四川主要养猪地区猪群猪2型链球菌(S.suis 2)的流行情况,本研究利用ELISA抗体检测试剂盒对来自四川地区15个市(区)526份猪血清样品进行S.suis 2血清流行病学调查。四川地区猪群血清调查的总阳性检出率为40.30%(212/526);按... 为了解近年来四川主要养猪地区猪群猪2型链球菌(S.suis 2)的流行情况,本研究利用ELISA抗体检测试剂盒对来自四川地区15个市(区)526份猪血清样品进行S.suis 2血清流行病学调查。四川地区猪群血清调查的总阳性检出率为40.30%(212/526);按地区分析,15个市(区)S.suis 2检出阳性率的地区占86.67%(13/15),其中阳性检出率超过50%地区占46.67%(7/15),宜宾地区的阳性检出率高达78.57%(11/14);按猪场分析,四川地区猪场S.suis 2阳性检出率高达76.74%(33/43),其中规模化猪场阳性检出率较高,为81.81%(18/22);在母猪、保育猪和育肥猪的猪群血清中,种母猪阳性检出率最高,为76.28%(74/97);并且夏季的阳性检出率最高,为46.81%(110/235)。研究表明S.suis 2在四川主要养猪地区普遍存在,并且在部分养猪区域、规模化猪场及种母猪猪群中存在较大的流行风险。本研究对四川主要养猪地区S.suis 2的流行和预防提供了调查依据。 展开更多

关键词 猪2型链球菌 四川 流行病学调查 ELISA

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一株猪流行性腹泻病毒强毒株的分离与鉴定 被引量：3

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作者 刘维哲 罗成刚 +6 位作者 袁蓉 廖艺杰 文艺悯 孙莹 俞恩波 曹三杰 黄小波 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期3049-3063,共15页

为了掌握猪流行性腹泻病毒(PEDV)最新流行毒株的病原特征与致病性,开展了PEDV的分离与鉴定。将PEDV阳性病料样品接种Vero细胞连续盲传,分离PEDV流行毒株,并开展了分离毒株的培养特性、全基因组序列分析和仔猪致病性评价。结果显示:传至... 为了掌握猪流行性腹泻病毒(PEDV)最新流行毒株的病原特征与致病性,开展了PEDV的分离与鉴定。将PEDV阳性病料样品接种Vero细胞连续盲传,分离PEDV流行毒株,并开展了分离毒株的培养特性、全基因组序列分析和仔猪致病性评价。结果显示:传至第3代(P3)分离出一株病毒,病毒在细胞上形成典型的“合胞体”样病变;电镜下病毒大小60~110 nm;P10到P35代滴度从10^(4.7)TCID_(50)·mL^(-1)升至10^(6.43)TCID_(50)·mL^(-1);CHN-SC2021(P5)基因组全长28014 bp(GenBank收录号:OM505025.1),与中国地区、欧美地区、亚洲其他国家毒株的相似性分别为99.16%~96.32%、99.01%~96.57%、98.94%~96.33%;系统进化树显示CHN-SC2021株与江西CH/JXJA/2017(MF375374.1)、河南CH/HNAY/2015(KT199103.1)、CH/HNKF-16(KY649107.1)毒株亲缘关系较近,属于GⅡa型毒株。S基因序列与参考毒株相似度在98.7%~93.4%。将CHN-SC2021病毒液以每头3 mL 10~5 TCID_(50)·mL^(-1)的剂量口服感染6日龄哺乳仔猪,12 h开始出现食欲不振,20 h时呕吐,24 h出现剧烈呕吐和黄色水样腹泻;剖检病变主要是胃肠臌气、空肠和回肠透明;组织病变显示各肠段均有不同程度的肠绒毛病变、脱落、结缔组织疏松、黏膜肌层与肌层间距增宽等;免疫组化结果显示小肠各段均有病毒,回肠中病毒最多。本研究分离获得一株GⅡa型的PEDV强毒株,有助于丰富我国PEDV的流行毒株信息及为临床防控提供参考。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 分离 鉴定 序列分析 哺乳仔猪 致病性

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四川猪传染性胸膜肺炎放线杆菌耐药基因流行规律与表型相关性研究 被引量：10

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作者 王佳凡 郑博文 +3 位作者 杨超 马晓平 曹三杰 黄小波 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期631-639,共9页

【目的】掌握四川省部分规模化养猪场猪传染性胸膜肺炎放线杆菌耐药基因流行规律与耐药表型相关性。【方法】对疑似患有猪传染性胸膜肺炎的病猪肺脏组织进行细菌分离鉴定和生化试验,并对分离株进行系统进化分析、耐药表型和耐药基因的... 【目的】掌握四川省部分规模化养猪场猪传染性胸膜肺炎放线杆菌耐药基因流行规律与耐药表型相关性。【方法】对疑似患有猪传染性胸膜肺炎的病猪肺脏组织进行细菌分离鉴定和生化试验,并对分离株进行系统进化分析、耐药表型和耐药基因的检测。【结果】从病变肺脏组织分离到11株疑似猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌株,呈革兰氏阴性短杆状,生化试验和DNA分子生物学鉴定11株分离株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。11株分离株呈多重耐药现象,对四环素和多西环素耐药率为90.90%;对盐酸林可霉素、复方新诺明和链霉素耐药率为54.55%;对盐酸克林霉素、庆大霉素、氯霉素和氟苯尼考耐药率为27.27%;对卡那霉素和红霉素耐药率分别为18.18%和9.10%。检测到sul3、tetB、tetC、ermB、floR、ant(6')-Ia、aph(2'')-Id和aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia 8种耐药基因,携带率分别为100%、40.0%、100%、100%、100%、85.7%、14.3%和14.3%,与耐药表型相符。【结论】该地区规模化养猪场发生呼吸道感染死亡育肥猪细菌性病原是猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,表现为多重耐药;分离株携带较多的耐药基因且与表型一致,为该病的防控和临床用药提供了科学依据。 展开更多

关键词 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 分离鉴定 耐药表型 耐药基因

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副猪革拉瑟菌影递送猪圆环病毒2型DNA二联疫苗的制备及小鼠免疫效果评价

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作者 王康 刘格言 +10 位作者 王宇 杨振 唐欣巍 曹三杰 黄小波 颜其贵 伍锐 赵勤 杜森焱 文心田 文翼平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1179-1191,共13页

本研究旨在研制猪圆环病毒2型(PCV2)-副猪革拉瑟菌(GPS)二联菌影疫苗,并评价其在小鼠上的免疫保护效果。选择GPS 5型菌株SH0165作为疫苗株,利用氢氧化钠最低抑菌浓度法将其制备成菌影,再将PCV2的ORF2基因克隆至pEGFP-N1真核表达质粒,将... 本研究旨在研制猪圆环病毒2型(PCV2)-副猪革拉瑟菌(GPS)二联菌影疫苗,并评价其在小鼠上的免疫保护效果。选择GPS 5型菌株SH0165作为疫苗株,利用氢氧化钠最低抑菌浓度法将其制备成菌影,再将PCV2的ORF2基因克隆至pEGFP-N1真核表达质粒,将GPS菌影作为PCV2 DNA疫苗的载体,构建PCV2-GPS二联菌影疫苗,设计了商品化疫苗组、PCV2-GPS二联菌影疫苗组、菌影组、质粒组、PBS组、空白组,对4周龄BALB/c小鼠进行免疫,测定免疫后PCV2和GPS的IgG抗体效价、PCV2中和抗体、脏器中PCV2病毒载量、血清杀菌率、GPS攻毒保护率以及血清中细胞因子(IFN-γ、IL-12)水平。结果显示:二联菌影疫苗组小鼠血清中PCV2和GPS的IgG抗体水平显著增高,PCV2中和抗体滴度提高,PCV2攻毒后的小鼠淋巴结和肺脏中病毒载量下降,血清杀菌率显著提高,GPS攻毒后免疫保护率达70%(7/10),小鼠血清中IFN-γ含量显著上调。综上表明,PCV2-GPS二联菌影疫苗显著激活了小鼠对PCV2和GPS的体液免疫反应和细胞免疫反应,且能够抑制PCV2在小鼠体内的增殖,对感染GPS的小鼠达到较好的保护效果,为新型安全高效的PCV2、GPS联合疫苗的研制提供了生物材料和实验数据。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 ORF2基因 副猪革拉瑟菌 菌影 小鼠 免疫保护

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四川省副猪嗜血杆菌分离株β-内酰胺类药物药敏特性及质粒介导耐药基因检测研究 被引量：4

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作者 魏海林 付丹 +6 位作者 王正皓 文心田 曹三杰 黄小波 伍锐 赵勤 文翼平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期186-189,共4页

为了给四川地区养猪场提供副猪嗜血杆菌(HPS)病的科学防控及合理的治疗用药方案,并研究HPS的β-内酰胺类药物的耐药机制,本实验于2014年8月～2016年9月,对四川省18个地区养猪场疑似感染HPS的病猪进行了解剖及病理变化观察,采集病料分离... 为了给四川地区养猪场提供副猪嗜血杆菌(HPS)病的科学防控及合理的治疗用药方案,并研究HPS的β-内酰胺类药物的耐药机制,本实验于2014年8月～2016年9月,对四川省18个地区养猪场疑似感染HPS的病猪进行了解剖及病理变化观察,采集病料分离并鉴定得到97株HPS,分别采用纸片法检测5种β-内酰胺类药物耐药情况,PCR检测5种质粒介导的β-内酰胺类耐药基因携带情况。结果显示,分离株中耐药菌株比例高达86.6%(84/97);分离株对氨苄西林、阿莫西林、青霉素、头孢噻肟、头孢唑啉的耐药率分别为63.9%(62/97)、56.7%(55/97)、74.2%(72/97)、37.1%(36/97)、29.9%(29/97),且多重耐药情况比较严重;86.6%(84/97)分离株的质粒至少携带一种耐药基因,耐药基因TEM、SHV、CTX、OXA、DHA的检出率分别为57.7%(56/97)、33.0%(32/97)、17.5%(17/97)、19.6%(19/97)、2.1%(2/97),有32株分离株携带2～3种耐药基因;耐药基因和耐药表型的符合率为88.1%(74/84)。HPS四川分离株对β-内酰胺类抗生素严重耐药,其质粒介导的β-内酰胺类耐药基因携带率较高。耐药基因和表型符合率较高,表明通过检测耐药基因来初步确定菌株的耐药情况可行性高。本研究为临床防治HPS病奠定了一定的基础。 展开更多

关键词 副猪嗜血杆菌 药敏试验 耐药基因 Β-内酰胺类药物

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猪细小病毒HNLY201301株遗传特性及其对小鼠的致病性研究 被引量：4

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作者 郑艺 徐伊璇 +7 位作者 彭文婧 曹三杰 颜其贵 黄小波 文翼平 赵勤 杜森焱 伍锐 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2022年第3期413-420,共8页

【目的】探究猪细小病毒HNLY201301株的遗传特性及其对小鼠的致病性。【方法】对HNLY201301株进行遗传学分析、生物学分析以及小鼠攻毒试验。【结果】HNLY201301株属于经典猪细小病毒1型(PPV1),具有强毒株的遗传特性。该毒株可在猪肾(PK... 【目的】探究猪细小病毒HNLY201301株的遗传特性及其对小鼠的致病性。【方法】对HNLY201301株进行遗传学分析、生物学分析以及小鼠攻毒试验。【结果】HNLY201301株属于经典猪细小病毒1型(PPV1),具有强毒株的遗传特性。该毒株可在猪肾(PK-15)细胞上复制,其滴度最高可达10^(-8.45)TCID_(50)/mL。该毒株的血凝谱广,能凝集小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、鸭和猪的红细胞。该毒株可通过静脉注射和阴道灌注感染小鼠,主要引起小鼠子宫损伤。【结论】细小病毒仍在我国猪场间流行,且具有较强致病性,对该病的防控应引起重视。 展开更多

关键词 猪细小病毒 基因组 分子特性 致病性 小鼠

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猪乙型脑炎病毒SCYA201201株感染小鼠后突破血脑屏障能力研究 被引量：2

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作者 柴春霞 王侨 +7 位作者 赖雅兰 徐伊璇 文心田 曹三杰 黄小波 文翼平 赵勤 伍锐 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期926-931,共6页

将猪乙型脑炎病毒SCYA201201株(F122代次,弱毒株)脑内接种小鼠,评估该病毒株对小鼠的致病性。通过腹腔接种小鼠,分别在接种后6、12、18、24 h观察小鼠脑部病理变化,同时利用荧光定量PCR方法检测其血液、脑组织E基因拷贝数,探究该毒株突... 将猪乙型脑炎病毒SCYA201201株(F122代次,弱毒株)脑内接种小鼠,评估该病毒株对小鼠的致病性。通过腹腔接种小鼠,分别在接种后6、12、18、24 h观察小鼠脑部病理变化,同时利用荧光定量PCR方法检测其血液、脑组织E基因拷贝数,探究该毒株突破小鼠血脑屏障的能力,从而评估SCYA201201株(F122代次)作为弱毒活疫苗的潜力。结果显示,SCYA201201株(F122代次)高度弱化,对乳鼠的脑内半数致死量(LD_(50))仅为4×10~5PFU·40μL^(-1)。该毒株腹腔接种24 h内,小鼠脑部未出现病理变化,且荧光定量PCR检测为阴性,表明该毒株不能突破小鼠的血脑屏障,具有很高的安全性。 展开更多

关键词 猪乙型脑炎病毒 半数致死量 荧光定量PCR 血脑屏障

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副猪嗜血杆菌耐药性研究进展 被引量：12

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作者 付丹 谭晓婷 +5 位作者 曹玉琴 文心田 曹三杰 黄小波 伍锐 文翼平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期591-594,共4页

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是猪上呼吸道共栖菌，能够从健康动物的鼻腔、鼻分泌物、气管和扁桃体中分离得到。同时，该菌也是一种条件性致病菌，可以受多种因素诱发，如应激、恶劣环境及其它病原感染等。该菌只感染猪... 副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是猪上呼吸道共栖菌，能够从健康动物的鼻腔、鼻分泌物、气管和扁桃体中分离得到。同时，该菌也是一种条件性致病菌，可以受多种因素诱发，如应激、恶劣环境及其它病原感染等。该菌只感染猪，主要引起断奶仔猪和保育猪发病，最常见于5周龄～8周龄的猪，病死率可达50％。 展开更多

关键词 副猪嗜血杆菌 耐药性 病原感染 上呼吸道 鼻分泌物 断奶仔猪 扁桃体 致病菌

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可视化芯片显色技术在病原学检测中的研究进展 被引量：4

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作者 赵玉佳 文心田 +7 位作者 马锐 杨国淋 滑翔 谨瑾 黄小波 曹三杰 文翼平 伍锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期159-162,共4页

基因芯片检测技术自20世纪90年代建立以来，以其快速、特异、高敏感性及高通量等优点而广泛应用于不同领域。但由于传统的芯片技术采用的是荧光素标记，如Cy3／Cy5荧光染料及量子点荧光标记等，这些标记方法的结果判定均需要依赖昂贵的... 基因芯片检测技术自20世纪90年代建立以来，以其快速、特异、高敏感性及高通量等优点而广泛应用于不同领域。但由于传统的芯片技术采用的是荧光素标记，如Cy3／Cy5荧光染料及量子点荧光标记等，这些标记方法的结果判定均需要依赖昂贵的荧光扫描仪，从而限制了芯片技术在临床上大规模的推广应用。 展开更多

关键词 检测技术 基因芯片 病原学 可视化 荧光素标记 显色 芯片技术 荧光标记

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猪病毒性腹泻检测基因芯片的两种样品标记技术比较 被引量：4

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作者 马锐 尹人杰 +9 位作者 黄小波 文心田 杨国淋 常晓霞 张仙 滑翔 赵玉佳 曹三杰 文翼平 伍锐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期752-761,共10页

对猪病毒性腹泻检测芯片的两种样品标记方法进行比较。分别选取猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(GAR)的VP7和NSP4基因设计引物,用PCR扩增制备靶基因,纯化后制备猪病毒性腹泻联合检... 对猪病毒性腹泻检测芯片的两种样品标记方法进行比较。分别选取猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(GAR)的VP7和NSP4基因设计引物,用PCR扩增制备靶基因,纯化后制备猪病毒性腹泻联合检测基因芯片。提取样品核酸,采用Cy3直接标记法和间接标记法进行PCR扩增标记,标记的样品再与芯片杂交、扫描和数据分析,同时对两种标记方法的特异性、敏感性等进行了比较。结果表明,两种方法标记的样品均能与基因芯片特异性杂交,但直接法的中位信号值(median)均高于间接法的中位信号值,直接法的芯片杂交信噪比是用间接法的5倍以上。两种标记方法制备样品特异性好,猪蓝耳病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒验证检测为阴性;直接法和间接法的最低检测浓度分别为10~5和10~7 copies·μL^(-1),前者的灵敏性是后者的100倍。应用优化的直接标记法处理56份临床样品,进行芯片的检测应用,结果与RT-PCR一致。本研究结果表明直接法荧光标记样品可明显提高病毒性腹泻检测芯片的检测效果。 展开更多

关键词 猪腹泻病毒 基因芯片 直接标记 间接标记 比较

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冠状病毒的氨基肽酶N受体的研究进展 被引量：6

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作者 陈杰 黄小波 +6 位作者 张雨迪 卿盈 李亚青 文心田 曹三杰 文翼平 伍锐 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期89-94,共6页

氨基肽酶N(Aminopeptidase N,APN)是一种锌离子依赖性膜结合II型的金属跨膜糖蛋白,其广泛存在于人和哺乳动物的多种组织细胞中。APN是多种冠状病毒的黏附性受体,参与冠状病毒的粘附与侵袭,与病毒感染密切相关。本文对多种冠状病毒(HCoV-... 氨基肽酶N(Aminopeptidase N,APN)是一种锌离子依赖性膜结合II型的金属跨膜糖蛋白,其广泛存在于人和哺乳动物的多种组织细胞中。APN是多种冠状病毒的黏附性受体,参与冠状病毒的粘附与侵袭,与病毒感染密切相关。本文对多种冠状病毒(HCoV-229E、FCoV、CCoV、TGEV、PEDV)的APN受体的结构、功能、抑制剂等研究进展进行了总结,重点介绍了其作为人和猪冠状病毒功能受体的进展。本文为深入研究和应用冠状病毒APN受体提供参考。 展开更多

关键词 氨基肽酶N 冠状病毒 受体

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多重PCR技术在猪病检测中的应用 被引量：4

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作者 马锐 黄小波 +2 位作者 杨国淋 滑翔 赵玉佳 《四川畜牧兽医》 2016年第5期31-33,共3页

多重PCR技术是一种实用的分子诊断技术,该技术能在同一反应体系中同步扩增多个目的片段,具有高效、快捷、敏感、特异等优势,适用于对大量临床样本的快速检测。本文就多重PCR的技术原理、在猪病检测中的技术类型(常规技术、分型技术、创... 多重PCR技术是一种实用的分子诊断技术,该技术能在同一反应体系中同步扩增多个目的片段,具有高效、快捷、敏感、特异等优势,适用于对大量临床样本的快速检测。本文就多重PCR的技术原理、在猪病检测中的技术类型(常规技术、分型技术、创新技术)等进行了叙述。 展开更多

关键词 多重PCR 猪病 检测 应用

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猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3

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作者 陈汭 付嘉钰 +10 位作者 刘浩宇 李成 赵玉佳 胡靖飞 瞿欢 曹三杰 文心田 文翼平 赵勤 伍锐 黄小波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期104-110,共7页

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Wester... 旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。 展开更多

关键词 猪δ冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体

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猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立 被引量：3

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作者 瞿欢 李成 +5 位作者 陈汭 廖艺杰 曹三杰 文翼平 颜其贵 黄小波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期273-280,共8页

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区(S1-CTD)并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区... 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区(S1-CTD)并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区(位于S基因的832-1 848 bp),构建原核表达载体pET28a-S1-CTD,表达的重组S1-CTD蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约41 kD,Western Blot证明其有良好的反应原性。以重组S1-CTD 蛋白为抗原建立间接ELISA,抗原最佳包被浓度为1μg/孔,待检血清的最佳稀释度为1∶50,阴阳性临界值为OD_(450nm)≥0.377。该ELISA检测其他8种常见猪病阳性血清无交叉反应,特异性好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性好。ELISA与病毒中和试验的总符合率达83.3%。用建立的ELISA检测了2012-2017年四川部分猪场490份临床血清,结果显示血清中PDCoV抗体阳性率为49.18%。 展开更多

关键词 猪丁型冠状病毒 S1-CTD蛋白 原核表达 间接ELISA

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共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化 被引量：2

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作者 胡靖飞 尹人杰 +7 位作者 黄小波 刘志鹏 赵玉佳 曹三杰 文心田 文翼平 赵勤 伍锐 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期542-549,578,共9页

【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩... 【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩增探针制备芯片阵列。重点改进了样品标记技术,引物直接标记与不对称PCR扩增结合,确定了不对称PCR扩增体系;并对点样缓冲液、水合时间、探针浓度、杂交时间和温度、清洗和干燥方式等条件进行优化。【结果】当博奥和百傲两种缓冲液比例为1∶1,水合时间为4 s,探针浓度为600 ng/μL,不对称PCR上下游引物比为1∶40,在48℃杂交3 h,用0.2%SDS清洗,1 000 r/min离心,该cDNA芯片效果最佳。【结论】本研究确定了PEDV-TGEV-GAR共检cDNA芯片的关键技术参数,为开展基因芯片的标准化制备和应用奠定了基础。 展开更多

关键词 猪腹泻病毒 CDNA芯片 直接标记法 不对称PCR 优化

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检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的构建 被引量：14

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作者 滑翔 胡中凯 +10 位作者 黄小波 文心田 曹三杰 文翼平 伍锐 邓静 赵松 尹人杰 常晓霞 欧阳达 张仙 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2235-2242,共8页

猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)是三种常见的仔猪病毒性腹泻病原,作者拟构建可同时检测三种病原的cDNA基因芯片。分别根据PEDV基因(S、M)、TGEV基因(S、N)、PoRV基因(VP7、NSP4)的保守区设计引物... 猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)是三种常见的仔猪病毒性腹泻病原,作者拟构建可同时检测三种病原的cDNA基因芯片。分别根据PEDV基因(S、M)、TGEV基因(S、N)、PoRV基因(VP7、NSP4)的保守区设计引物扩增靶基因,进行PEDV-TGEV-PoRV的cDNA阵列设计,建立了扩增标记探针的多重PCR方法,并对所构建cDNA芯片的特异性、灵敏性、重复性进行了评价。确定了该cDNA芯片的阳性判断标准:SNR大于或等于2.0(或信号强度中位值大于等于1 500)。PEDV-TGEV-PoRV诊断cDNA芯片具有良好的特异性,该芯片不与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应;芯片的最低检测质量浓度为20pg·μL-1;同一张芯片可重复使用至少7次。本研究为鉴别三种仔猪病毒性病的鉴别诊断提供了新的高通量检测技术。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪轮状病毒 CDNA芯片 构建

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猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备 被引量：11

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作者 李成 张雨迪 +8 位作者 黄小波 刘浩宇 刘志鹏 赵玉佳 曹三杰 文心田 文翼平 赵勤 伍锐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1256-1264,共9页

本研究旨在克隆猪丁型冠状病毒(PDCoV)S1基因(1—1 566bp),体外表达S1基因抗原表位预测区Sa(106—1 290bp)蛋白并制备抗该蛋白质的多克隆抗体。运用生物信息学软件分析S1核苷酸和编码氨基酸序列特征,将S1基因抗原表位预测区Sa克隆至原... 本研究旨在克隆猪丁型冠状病毒(PDCoV)S1基因(1—1 566bp),体外表达S1基因抗原表位预测区Sa(106—1 290bp)蛋白并制备抗该蛋白质的多克隆抗体。运用生物信息学软件分析S1核苷酸和编码氨基酸序列特征,将S1基因抗原表位预测区Sa克隆至原核表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b-Sa,转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达、超滤柱浓缩纯化重组蛋白、Ni柱亲和层析,Western blot检测Sa蛋白的活性,将Sa蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果表明,CHN-2015毒株S1基因开放型阅读框大小为1 566bp(GenBank No.KY398009),编码522个氨基酸,是具有亲水性的非跨膜蛋白,存在15个潜在的B细胞抗原表位;原核表达Sa重组蛋白,该蛋白质在37℃下用终浓度为0.8mmol·L^(-1)IPTG诱导5h后,蛋白质主要以可溶性形式存在,免疫印迹显示表达的Sa蛋白在上清与包涵体中都有良好的反应性;用纯化的Sa蛋白四次免疫家兔,获得的兔抗Sa蛋白抗体效价可达1∶10 240。本研究克隆了S1基因,原核表达了Sa蛋白和制备了高效价的兔抗Sa蛋白抗体,具有良好的免疫原性,为后续深入开展S蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪丁型冠状病毒 S1基因 克隆 原核表达 抗原性 多克隆抗体

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人氨基肽酶N在猪丁型冠状病毒感染HEK293细胞中的作用

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作者 赵玉佳 陈汭 +11 位作者 宋代丽 张路文 肖黛 李施倩 文翼平 伍锐 赵勤 杜森焱 颜其贵 文心田 曹三杰 黄小波 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1587-1597,共11页

以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因... 以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因的HEK293细胞系,通过CCK-8试验验证敲除细胞和野生型细胞的细胞活性;用RT-qPCR和Western blot检测hAPN敲除和过表达对PDCoV复制的影响;进一步通过同源建模和分子对接预测PDCoV S蛋白和hAPN蛋白的结合位点。结果显示:PDCoV在感染HEK293细胞后12~36 h快速增殖,在36 h达到顶峰,在HEK293细胞上至少可传至2代;hAPN敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无明显差异,细胞敲除hAPN可显著抑制PDCoV复制,细胞过表达hAPN可促进PDCoV复制;同源建模和分子对接表明,S1蛋白可与hAPN蛋白结构域II结合,主要是S1蛋白的受体结合基序1(receptor binding motif 1,RBM1)氨基酸残基TYR^(92)、THR^(51)、THR^(48)、PHE^(16)和MET^(14)通过氢键与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE^(490)、GLN^(531)、ARG^(528)和SER^(529)结合。hAPN在PDCoV感染人源细胞中发挥重要作用,为深入研究PDCoV的细胞入侵和跨种传播机制提供了新的理论依据。 展开更多

关键词 猪丁型冠状病毒 氨基肽酶N HEK293细胞 复制

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四川部分地区猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体检测结果分析 被引量：4

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作者 罗成刚 黄小波 +1 位作者 袁蓉 王定国 《中国动物保健》 2022年第11期15-16,18,共3页

猪瘟(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)是危害我国养猪业的两类重要的传染性疾病,为了评估四川部分地区规模化养殖场猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果,本研究采用酶联免疫方法(ELISA)对四川成都、广元、攀枝花、内江四个猪场送检... 猪瘟(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)是危害我国养猪业的两类重要的传染性疾病,为了评估四川部分地区规模化养殖场猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫效果,本研究采用酶联免疫方法(ELISA)对四川成都、广元、攀枝花、内江四个猪场送检的213份猪血清样本进行了CSFV和PRRSV抗体检测。结果表明:有168份血清CSFV免疫抗体阳性,阳性率为78.87%,四个猪场中阳性率最高为89.80%,最低为63.93%;162份PRRSV抗体阳性,阳性率为76.06%,四个猪场中阳性率最高为93.15%,最低为57.38%。按不同猪群统计显示,母猪及公猪群体的猪瘟疫苗免疫效果较好,仔猪群体具有较好的母源抗体,而保育猪猪瘟免疫抗体数据较差,提示仔猪猪瘟的免疫程序及免疫剂量需要进行调整。猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体中母猪免疫抗体效果差异明显,提示部分养殖场母猪的免疫程序及免疫剂量需进行调整。本研究结果可以为四川地区规模化养殖场CSFV与PRRSV防控提供技术支撑。 展开更多

关键词 猪瘟 猪繁殖与呼吸综合征 抗体 检测 免疫效果

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