几种肿瘤免疫抑制因子作用的研究 被引量：7

1

作者 郝天玲 张桂梅 +2 位作者 冯作化 张慧 姜志尧 《同济医科大学学报》 CSCD 北大核心 1995年第2期105-108,共4页

通过体外细胞培养，采用ＭＴＴ法和ＮＯ测定法，观察了淋巴瘤（Ｒａｊｉ）、实体瘤（Ｓ_（１８０））、艾氏腹水瘤（ＥＡＣ）、肝癌（ＨＣ）４种肿瘤细胞产生的肿瘤免疫抑制因子（ＴＤＳＦ）对小鼠腹腔巨噬细胞产生ＮＯ和Ｔ淋巴细胞激... 通过体外细胞培养，采用ＭＴＴ法和ＮＯ测定法，观察了淋巴瘤（Ｒａｊｉ）、实体瘤（Ｓ_（１８０））、艾氏腹水瘤（ＥＡＣ）、肝癌（ＨＣ）４种肿瘤细胞产生的肿瘤免疫抑制因子（ＴＤＳＦ）对小鼠腹腔巨噬细胞产生ＮＯ和Ｔ淋巴细胞激活的影响。结果发现Ｒａｊｉ－ＴＤＳＦ和Ｓ_（１８０）－ＴＤＳＦ对巨噬细胞产生ＮＯ均有明显的促进作用（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）．而ＥＡＣ－ＴＤＳＦ和ＨＣ－ＴＤＳＦ则否（Ｐ＞０．０５），它们对Ｔ淋巴细胞激活的抑制作用Ｓ_（１８０）－ＴＤＳＦ和ＥＡＣ－ＴＤＳＦ可被大蒜素（ＤＡＴＳ）所拮抗，与无ＤＡＴＳ组比较抑制率明显下降（Ｐ＜０．０１）；而ＤＡＴＳ却不能拮抗Ｒａｊｉ－ＴＤＳＦ和ＨＣ－ＴＤＳＦ的抑制作用（Ｐ＞０．０５）。结果表明，不同肿瘤细胞产生的ＴＤＳＦ的作用及其机制可能是多样的。 展开更多

关键词 肿瘤 免疫抑制因子 一氧化氮 大蒜素 TDSF T细胞

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双功能域重组FN多肽抑制癌细胞浸润能力的研究 被引量：8

2

作者 张桂梅 冯作化 +2 位作者 张慧 李东 范曲 《同济医科大学学报》 CSCD 1998年第1期6-9,共4页

在制备了两个Cell Ⅰ-Hep Ⅱ 双结构域重组FN多肽(CH50和CH56)的基础上,研究其抑制肿瘤细胞浸润能力的作用。两个多肽的结构差异是CH50中删除了Cell I和HepⅡ之间的Ⅲ-11和ED-A结构顺序。CH50(ED_(50)为30.2 nmol/L)结合细胞的能力略高... 在制备了两个Cell Ⅰ-Hep Ⅱ 双结构域重组FN多肽(CH50和CH56)的基础上,研究其抑制肿瘤细胞浸润能力的作用。两个多肽的结构差异是CH50中删除了Cell I和HepⅡ之间的Ⅲ-11和ED-A结构顺序。CH50(ED_(50)为30.2 nmol/L)结合细胞的能力略高于CH56(ED_(50)为45.4 nmol/L)。两种多肽均可显著抑制黑色素瘤B16/F1细胞结合层粘素的能力,抑制作用相同。在体内肿瘤浸润抑制试验中,两种多肽均可显著抑制癌细胞浸润能力,使肺转移结节数降低80％左右。结果提示:Ⅲ-11和ED-A结构顺序对Cell Ⅰ-Hep Ⅱ 双结构域多肽结合细胞的能力有一定的影响,但删除Ⅲ-11和ED-A不是重组多肽抑制肿瘤转移的决定因素,Cell I和Hep Ⅱ 这两个结构域单独连接在一起是其抑制肿瘤细胞转移的结构基础。 展开更多

关键词 重组FN多肽 肿瘤转移 黑色素瘤 肿瘤抑制

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新型大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体的构建及卡那霉素抗性基因表达的研究 被引量：9

3

作者 路艳艳 冯作化 +1 位作者 皇甫永穆 郑波 《同济医科大学学报》 CSCD 1998年第2期89-93,共5页

用 PCR（polymerase chain reaction）技术克隆了卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）热休克蛋白 65（heat shock Protein 65, hsp65）启动子序列,构建成穿梭载体ME-65。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因、BCG的hsp65高... 用 PCR（polymerase chain reaction）技术克隆了卡介苗（Bacille Calmette-Guerin,BCG）热休克蛋白 65（heat shock Protein 65, hsp65）启动子序列,构建成穿梭载体ME-65。该载体含有分枝杆菌和大肠杆菌的质粒复制基因、BCG的hsp65高效启动子序列以及在分枝杆菌和大肠杆菌中都能表达的卡那霉素抗性基因。将其转化到耻垢分枝杆菌和BCG中均可稳定复制并表达卡那霉素抗性。质粒对宿主菌的生长无明显的影响,未观察到质粒的丢失和突变。该载体具有分子量小、容量大、转化效率高、复制稳定、含有多克隆位点等优点,将外源基因插入到hsp65启动子的下游,可望在BCG中获得高效表达。为BCG和其它分枝杆菌发展成多价重组疫苗开辟了新途径。 展开更多

关键词 分枝杆菌 穿梭质粒 卡介苗 基因工程 大肠杆菌

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寡核苷酸的卟啉化学修饰及其产物纯化的研究 被引量：1

4

作者 吴蒙 夏淑贞 +1 位作者 杨渝珍 韩玲 《同济医科大学学报》 CSCD 1998年第3期177-180,共4页

为探索寡核苷酸的修饰方法,合成了一种卟啉修饰的反义寡核苷酸并对其抑制c-myc靶基因表达的效果进行了初步探索。利用卟啉的1-羟基苯并三氮唑活性酯可将卟啉基团直接修饰在商品化的寡核苷酸片断上。用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合红外、紫外... 为探索寡核苷酸的修饰方法,合成了一种卟啉修饰的反义寡核苷酸并对其抑制c-myc靶基因表达的效果进行了初步探索。利用卟啉的1-羟基苯并三氮唑活性酯可将卟啉基团直接修饰在商品化的寡核苷酸片断上。用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合红外、紫外测定完成寡核苷酸偶合物的鉴定。与其他类似研究相比,此法简便易行,具有较宽的应用范围。 展开更多

关键词 寡核苷酸 反义技术 卟啉类 C-MYC基因 化学修饰

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体内IL-2基因和IFN-γ基因转染巨噬细胞抗肿瘤作用的研究

5

作者 周滨 姜志尧 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1998年第1期24-27,共4页

将IL-2或/和IFN-γ基因体内转染腹腔巨噬细胞(MΦ),其表达的基因产物能提高MΦ的细胞毒活性,并诱导MΦ分泌TNF、IL-1和NO等抗肿瘤免疫介质.激发机体的非特异性免疫功能而产生抗肿瘤效应,特别是IL-2和IFN-γ基因联合转染MΦ,其表达的基... 将IL-2或/和IFN-γ基因体内转染腹腔巨噬细胞(MΦ),其表达的基因产物能提高MΦ的细胞毒活性,并诱导MΦ分泌TNF、IL-1和NO等抗肿瘤免疫介质.激发机体的非特异性免疫功能而产生抗肿瘤效应,特别是IL-2和IFN-γ基因联合转染MΦ,其表达的基因产物既能使MΦ产生更强的细胞毒活性并分泌高水平的TNF、IL-1和NO,又能激活脾CTL细胞,从而激发机体的非特异性和特异性免疫功能,产生更强的快同抗肿瘤效应.结果表明。 展开更多

关键词 肿瘤 基因治疗 基因转染 IL-2 巨噬细胞 IFNΓ

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体内IL-2基因转染巨噬细胞对恢复化疗所致造血及免疫功能损伤的研究

6

作者 周滨 姜志尧 冯作化 《同济医科大学学报》 CSCD 1998年第6期423-426,共4页

摘要 采用磷酸钙-DNA共沉淀法,将IL-2真核表达载体直接注射至经大剂量化疗后的小鼠腹腔内,可成功地转染腹腔巨噬细胞（MФ）,并表达基因产物,能刺激脾脏淋巴细胞增殖,提高腹腔MФ的细胞毒活性,并促使腹腔MФ产生大量的IL-1、TNF和NO。... 摘要 采用磷酸钙-DNA共沉淀法,将IL-2真核表达载体直接注射至经大剂量化疗后的小鼠腹腔内,可成功地转染腹腔巨噬细胞（MФ）,并表达基因产物,能刺激脾脏淋巴细胞增殖,提高腹腔MФ的细胞毒活性,并促使腹腔MФ产生大量的IL-1、TNF和NO。还能使化疗后处于低水平的白细胞和血小板显著回升,降低化疗后白细胞和血小板数量的减少程度,并显著提高外周血淋巴细胞和单核细胞的数量。提示IL-2基因转染MФ可能有助于肿瘤患者放疗、化疗后造血功能损伤的恢复和免疫功能重建。 展开更多

关键词 基因转染 IL-2 免疫功能 造血 巨噬细胞 化疗

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HL-60细胞诱导分化与细胞膜流动性变化研究

7

作者 张希红 杨渝珍 +2 位作者 夏庆苏 邵超鹏 陈兆聪 《生物化学杂志》 CSCD 1991年第5期539-543,共5页

本实验以二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)为诱导剂,诱导人早幼粒白血病细胞系HL-60沿粒系统成熟分化。动态观察了诱导后1—6天HL-60的形态、功能成熟度改变、膜流动性和增殖活性的变化。结果表明,早幼粒细胞由诱导前的78％降至5％... 本实验以二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)为诱导剂,诱导人早幼粒白血病细胞系HL-60沿粒系统成熟分化。动态观察了诱导后1—6天HL-60的形态、功能成熟度改变、膜流动性和增殖活性的变化。结果表明,早幼粒细胞由诱导前的78％降至5％,杆核与分叶核细胞由6％和1.5％分别增加至32.5％和5.5％。NBT(Nitroblue tetrazolium,四唑氮蓝)还原试验显示其功能亦渐超成熟。诱导后HL-60 DNA合成速率明显降低(降低40～75％),膜脂流动度亦显著降低(降低30％,P<0.01)。提示诱导分化后的HL-60细胞不仅获得了与正常成熟粒细胞相似的形态功能特征,同时还失去了膜流动性增高及快速繁殖增生的恶性特征。 展开更多

关键词 白血病 细胞 分化 膜流动性 DMSO

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日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达 被引量：8

8

作者 程继忠 皇甫永穆 +1 位作者 海涛 梁驹卿 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第6期661-667,共7页

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链... 研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术，以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板，经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序，克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）７０的启动子下游，再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原，所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见，Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达． 展开更多

关键词 BCG 日本血吸虫 26kD抗原基因 基因表达

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特异基因的PCR扩增及其快速克隆 被引量：4

9

作者 张大军 钱明 +3 位作者 李东 梁驹卿 皇甫永穆 陈秋生 《同济医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1994年第3期167-170,共4页

采用聚合酶链反应(PCR)技术，直接从微生物基因组中扩增卡介苗Ag85-B和HBsAg编码基因。虽然在引物5'端设计了限制性内切酶识别顺序以及附加顺序，但因限制性内切酶不能切开这些顺序，使扩增基因产物不能克隆到质粒载体中。因此，我... 采用聚合酶链反应(PCR)技术，直接从微生物基因组中扩增卡介苗Ag85-B和HBsAg编码基因。虽然在引物5'端设计了限制性内切酶识别顺序以及附加顺序，但因限制性内切酶不能切开这些顺序，使扩增基因产物不能克隆到质粒载体中。因此，我们构建了新的克隆载体即T载体，专门用于克隆未经任何修饰的PCR产物；这种方法价廉，快速有效，值得推广应用。 展开更多

关键词 聚合酶链反应 克隆 T载体 基因

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日本血吸虫26ku抗原基因在分枝杆菌和大肠杆菌中的高效表达 被引量：5

10

作者 程继忠 皇甫永穆 +1 位作者 梁驹卿 陈秋生 《同济医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1996年第3期173-179,共7页

构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000,并将日本血吸虫26ku抗原(Sj26GST)基因在分枝杆菌中进行了克隆和表达.以质粒pBluescript sk为骨架,分别克隆入分枝杆菌质粒复制基因、Neo基因(编码卡那霉素抗性)以及人结核杆菌热休克蛋白70(... 构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000,并将日本血吸虫26ku抗原(Sj26GST)基因在分枝杆菌中进行了克隆和表达.以质粒pBluescript sk为骨架,分别克隆入分枝杆菌质粒复制基因、Neo基因(编码卡那霉素抗性)以及人结核杆菌热休克蛋白70(heat shock protein,hsp70)的启动子,并带有质粒pBluescript的多克隆位点,构建成分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG-2000.该重组质粒在分枝杆菌、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制,并表达卡那霉素抗性.再以大肠杆菌表达质粒pGEX衍生质粒为模板,经过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)得到编码日本血吸虫26ku抗原的全长DNA顺序.将其按正确的阅读框顺序,精确克隆到分枝杆菌hsp70的启动子下游,最终构建成能高效表达Sj26GST的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG-Sj26.所表达的天然重组Sj26GST(rSi26GST)为可溶性蛋白,在SDS-PAGE上分子量为26ku处可见明显的表达蛋白带.提示生长缓慢的人结核杆菌hsp70的启动子能被快速生长的耻垢分枝杆菌RNA聚合酶所识别.通过薄层扫描分析,其表达效率分别占大肠杆菌、分枝杆菌菌体总蛋白的25%～37%和18%.本研究为外源基因在卡介苗(Bacille Calmette-Gu(?)rin,BCG)中的表达以及把分枝杆菌和BCG发展成为多价疫苗载体奠定了基础. 展开更多

关键词 分枝杆菌 穿梭质粒 日本血吸虫 基因表达

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叶酸、维生素C与5-氟尿嘧啶合并用药对孕鼠和胚胎的毒性 被引量：2

11

作者 皇甫永穆 李萍 +2 位作者 王建平 季金林 何善述 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1991年第3期214-216,共3页

本文观察了5-FU对孕鼠、胚胎的毒性,发现随剂量的增加毒性增强,孕鼠、胚胎体重减轻、生长迟缓,胚胎吸收率增加。若同时给维生素C、叶酸,不仅不能使5-FU的毒性减轻,反而使其毒性增加,胚胎吸收率及血清球蛋白升高,胚胎存活率、胚胎正常发... 本文观察了5-FU对孕鼠、胚胎的毒性,发现随剂量的增加毒性增强,孕鼠、胚胎体重减轻、生长迟缓,胚胎吸收率增加。若同时给维生素C、叶酸,不仅不能使5-FU的毒性减轻,反而使其毒性增加,胚胎吸收率及血清球蛋白升高,胚胎存活率、胚胎正常发育率、血清白蛋白及白/球比值均降低。结果表明维生素C、叶酸与5-FU合并用药可明显增强5-FU的毒性。 展开更多

关键词 叶酸 维生素C 5-氟脲嘧啶 毒性

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日本血吸虫32ku抗原基因的克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达 被引量：8

12

作者 肖红 郑波 +1 位作者 祁学忠 皇甫永穆 《同济医科大学学报》 CSCD 2000年第1期5-7,共3页

日本血吸虫３２ ｋｕ抗原（简称ｓｊ３２ｋｕ）是血吸虫的一种保护性抗原，为研究其重组疫苗的保护作用，将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒 ｐＢＣＧ２１００，受控于人结核杆菌热休克蛋白 ７０（Ｈｅａｔ ｓ... 日本血吸虫３２ ｋｕ抗原（简称ｓｊ３２ｋｕ）是血吸虫的一种保护性抗原，为研究其重组疫苗的保护作用，将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒 ｐＢＣＧ２１００，受控于人结核杆菌热休克蛋白 ７０（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ ７０，简称ｈｓｐ７０）启动子，构建成重组表达质粒 ｐＢＣＧ－ｓｊ３２，在大肠杆菌－分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于 ４２℃诱导 ２ ｈ或 ４５℃诱导 ３０ ｍｉｎ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，在 ３２ ｋｕ的位置能见到明显的蛋白条带，表明 ３２ ｋｕ抗原能在分枝杆菌中高效表达。 展开更多

关键词 分枝杆菌 日本血吸虫 疫苗 基因表达

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重组FN多肽CH50及IFN-γ对化疗小鼠免疫功能影响的比较 被引量：4

13

作者 曹慧青 冯作化 +2 位作者 张桂梅 张慧 范曲 《同济医科大学学报》 CSCD 1999年第3期191-193,共3页

腹腔连续注射ＣＨ５０或腹腔内转染ＩＦＮ－γ基因能减弱或防止化疗药物对免疫功能的抑制作用，减轻或防止化疗药物使外周血单核细胞数量和腹腔细胞的数量降低（Ｐ＜０．０５），促进巨噬细胞代谢活性、杀瘤活性以及分泌细胞因子的能力... 腹腔连续注射ＣＨ５０或腹腔内转染ＩＦＮ－γ基因能减弱或防止化疗药物对免疫功能的抑制作用，减轻或防止化疗药物使外周血单核细胞数量和腹腔细胞的数量降低（Ｐ＜０．０５），促进巨噬细胞代谢活性、杀瘤活性以及分泌细胞因子的能力（Ｐ＜０．０５，＜０．０１）；促进脾淋巴细胞的增殖反应能力（Ｐ＜０．０５，＜０．０１）。注射ＣＨ５０的作用早于ＩＦＮ－γ基因转染的作用。结果提示ＣＨ５０可改善肿瘤化疗药物疗效。 展开更多

关键词 重组多肽 干扰素 FN 免疫功能 肿瘤 药物疗法

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利用核酸外切酶Ⅲ体外缺失法构建PTLIL-2△n系列缺失质粒 被引量：3

14

作者 张大军 冯博 +2 位作者 皇甫永穆 陈兆聪 李东 《同济医科大学学报》 CSCD 北大核心 1992年第4期274-276,共3页

PTLIL-2是一个含有人白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)cDNA克隆的细菌质粒,含有该质粒的宿主菌虽然表达IL-2,但表达效率不理想。我们利用核酸外切酶在Ⅲ(exonucleaseⅢ,ExoⅢ),采用两种不同的方法,缺失IL-2 cDNA 3′端非编码顺序,获得... PTLIL-2是一个含有人白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)cDNA克隆的细菌质粒,含有该质粒的宿主菌虽然表达IL-2,但表达效率不理想。我们利用核酸外切酶在Ⅲ(exonucleaseⅢ,ExoⅢ),采用两种不同的方法,缺失IL-2 cDNA 3′端非编码顺序,获得了含有IL-2片段长度不同的系列缺失质粒PTLIL-2△n;并从中筛选出数个较高效表达IL-2的质粒。该两法简便易行,在基因工程领域中有一定推广价值。 展开更多

关键词 基因缺失 白细胞介素 基因工程

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人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定 被引量：5

15

作者 程继忠 梁驹卿 +2 位作者 肖红 海涛 皇甫永穆 《同济医科大学学报》 CSCD 1997年第5期331-335,共5页

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆... 用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。 展开更多

关键词 结核杆菌 卡介苗 启动子 热休克蛋白

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电穿孔法对分枝杆菌进行高效基因转化 被引量：17

16

作者 路艳艳 皇甫永穆 《北京医科大学学报》 CSCD 2000年第2期178-181,共4页

目的 :探讨卡介苗 (BacilleCalmette Guerin ,BCG)分枝杆菌的电穿孔转化方法及其影响因素。方法 :在基因脉冲仪上用电穿孔法对快生长型耻垢分枝杆菌———M .Smegmatismc2 15 5和BCG电转化大肠杆菌 分枝杆菌穿梭质粒ME 6 5。结果 :电... 目的 :探讨卡介苗 (BacilleCalmette Guerin ,BCG)分枝杆菌的电穿孔转化方法及其影响因素。方法 :在基因脉冲仪上用电穿孔法对快生长型耻垢分枝杆菌———M .Smegmatismc2 15 5和BCG电转化大肠杆菌 分枝杆菌穿梭质粒ME 6 5。结果 :电穿孔法可以成功地转化两种分枝杆菌 ,筛选出卡那霉素抗性菌株。通过对转化子提取质粒进行酶切鉴定和PCR扩增均证明为阳性重组体。转化效率达 10 4 / μgDNA。重组质粒可以在分枝杆菌中稳定复制。初步结果表明 ,质粒DNA的构象和浓度、初始培养物的浓度和活力、电转化参数包括电压、电阻以及转化前对菌体的冰浴时间等都对转化效率有一定的影响。结论 :BCG重组疫苗研制中分枝杆菌的基因转化问题的解决为研制能表达分枝杆菌及其它感染性疾病或肿瘤抗原的BCG多价重组疫苗提供了实验基础。 展开更多

关键词 分枝杆菌 卡介苗 电穿孔 基因转化

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双Tac启动子的构建及其对人白细胞介素2在大肠杆菌中表达的影响 被引量：2

17

作者 张大军 冯博 皇甫永穆 《同济医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1993年第4期226-229,共4页

采用基因工程技术,在表达质粒 PTLIL-2中于人白细胞介素 2(interleukin 2,IL-2)cD-NA 片段前插入了来自质粒PDR540的含Tac 启动子的片段,并适当调整SD 序列与ATG 密码之间的距离,构建成含双Tac 启动子和双SD 序列的质粒 PTLIL-2DT。结... 采用基因工程技术,在表达质粒 PTLIL-2中于人白细胞介素 2(interleukin 2,IL-2)cD-NA 片段前插入了来自质粒PDR540的含Tac 启动子的片段,并适当调整SD 序列与ATG 密码之间的距离,构建成含双Tac 启动子和双SD 序列的质粒 PTLIL-2DT。结果该重组质粒的IL-2 基因在大肠杆菌中表达效率提高了4倍。本文对重组 IL-2抽提和生物活性恢复的处理方法也作了探讨。 展开更多

关键词 操纵子 白细胞介素2 基因表达

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日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠免疫应答的影响 被引量：4

18

作者 戴五星 郑波 皇甫永穆 《同济医科大学学报》 CSCD 2000年第1期1-3,共3页

采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时，断头取血，取脾脏，取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力，以ＮＯ湫得检测巨噬细胞吞噬活性，以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及... 采用日本血吸虫重组ＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫８周时，断头取血，取脾脏，取腹腔巨噬细胞。以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力，以ＮＯ湫得检测巨噬细胞吞噬活性，以ＥＬＩＳＡ试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的白细胞介素２（ＩＬ－２＿和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）的含量。结果表明，ｒＢＣＧ－Ｓｊ２６ＧＳＴ疫苗以１０＾－６ＣＦＵ剂量经皮下免疫小鼠后。 展开更多

关键词 日本血吸虫 重组BCG疫苗 免疫应答 疫苗

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百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化 被引量：2

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作者 郑波 程继忠 +3 位作者 皇甫永穆 海涛 戴五星 王建平 《同济医科大学学报》 CSCD 1999年第1期17-20,共4页

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达，并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位... 研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达，并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基，将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端，构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清，为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统，一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化，得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。 展开更多

关键词 百日咳杆菌毒素 S1亚单位 基因表达 疫苗

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分枝杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因在分枝杆菌中的稳定表达 被引量：1

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作者 张大军 皇甫永穆 +2 位作者 钱明 梁驹卿 李东 《同济医科大学学报》 CSCD 北大核心 1995年第4期245-248,共4页

卡介苗（ＢＣＧ）是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ｐＵＣ１９为骨架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列（编码卡那霉素抗性）以及分枝杆菌质... 卡介苗（ＢＣＧ）是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ｐＵＣ１９为骨架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列（编码卡那霉素抗性）以及分枝杆菌质粒复制基因，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－８０００。该重组质粒在分枝杆菌（含ＢＣＧ）、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制，并能稳定表达卡那霉素抗性。本研究为把ＢＣＧ和其它分枝杆菌发展成为多价疫苗载体打下了基础。 展开更多

关键词 分枝杆菌 穿梭质粒 卡介苗 基因表达 载体

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