应用MABA法与试管法测定蛇床子素和8-甲氧基补骨脂素体外抗结核活性的研究 被引量：4

1

作者 曾范利 于录 +1 位作者 葛发 王全凯 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期112-115,共4页

为筛选有开发价值的抗结核中草药,本研究通过MABA(Microdilution MABA Assay)与试管法分别测定蛇床子素和8-甲氧基补骨脂素对结核分支杆菌H37Rv(ATCC27294)和H37Ra(ATCC25177)的体外抗菌活性,即最低抑菌浓度(MIC),同时比较两种方法的检... 为筛选有开发价值的抗结核中草药,本研究通过MABA(Microdilution MABA Assay)与试管法分别测定蛇床子素和8-甲氧基补骨脂素对结核分支杆菌H37Rv(ATCC27294)和H37Ra(ATCC25177)的体外抗菌活性,即最低抑菌浓度(MIC),同时比较两种方法的检测结果;并以MTT法研究蛇床子素和8-甲氧基补骨脂素对Balb/C小鼠的脾细胞和肝细胞的细胞毒性试验。蛇床子素和8-甲氧基补骨脂素对这两种结核菌的最低抑菌浓度分别均为32μg/mL和128μg/mL,并且对BALB/c小鼠的脾细胞和肝细胞均无毒性。MABA法与试管法相比较,完全符合率为90%(9/11),具有较好的一致性。本研究为蛇床子素和8-甲氧基补骨脂素作为抗结核药物的开发及它们的抗菌机制研究奠定了基础。 展开更多

关键词 蛇床子素 8-甲氧基补骨脂素 结核分支杆菌 最低抑菌浓度

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胞外捕获器:固有免疫细胞第三种防御机制的研究进展 被引量：3

2

作者 廖成水 Boireau Pascal +1 位作者 刘明远 程相朝 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1768-1774,共7页

胞外捕获器(extracellular traps,ETs)的释放是近来新发现的一种由DNA和颗粒蛋白组成的固有免疫防御机制。作为继吞噬作用、自噬之后的第三种杀伤机制,大量的研究已经证实ETs在体内外可捕获和杀伤绝大多数的细菌、病毒、真菌和寄生虫,... 胞外捕获器(extracellular traps,ETs)的释放是近来新发现的一种由DNA和颗粒蛋白组成的固有免疫防御机制。作为继吞噬作用、自噬之后的第三种杀伤机制,大量的研究已经证实ETs在体内外可捕获和杀伤绝大多数的细菌、病毒、真菌和寄生虫,作者对ETs的概念、形成的分子机制以及ETs在宿主防御中的作用进行了简要的介绍,这将对固有免疫细胞防御策略的新认识具有重要的意义。 展开更多

关键词 固有免疫细胞 胞外捕获器 外捕作用 杀菌活性

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狂犬病病毒M蛋白胞内合成和分布初步研究 被引量：1

3

作者 赵维荣 赵铭昕 +5 位作者 徐婧 张丹玮 郭艺迪 关振宏 段铭 张茂林 《广东农业科学》 CAS 2021年第4期111-118,共8页

【目的】狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是一种主要由核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、依赖RNA的RNA聚合酶蛋白(L)5种结构蛋白组成的高度嗜神经性病毒。RABV基因组RNA与N蛋白、P蛋白和L蛋白组成核糖核蛋白复合体(RNP),M... 【目的】狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是一种主要由核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、依赖RNA的RNA聚合酶蛋白(L)5种结构蛋白组成的高度嗜神经性病毒。RABV基因组RNA与N蛋白、P蛋白和L蛋白组成核糖核蛋白复合体(RNP),M蛋白在调控RABV病毒结构蛋白的合成和装配过程中起重要作用。但RABV不同毒株M蛋白胞内合成、分布场所及其是否存在差异尚不清楚。研究不同RABV毒株M蛋白与内质网、高尔基体以及M蛋白与G蛋白、M蛋白与RNP在N_(2)A和BHK细胞内的共定位,以期确定RABV M蛋白的胞内合成途径和分布场所。【方法】测定RABV不同毒株(CVS-11、SRV-9、PB4)在N_(2)A或BHK细胞的TCID_(50),以相同的MOI接毒,通过免疫荧光研究M蛋白与内质网、高尔基体的共定位,以及M蛋白与G蛋白、M蛋白与RNP(为N蛋白代表)的共定位。【结果】RABV不同毒株效价存在一定差异。在N_(2)A和BHK细胞中,不同RABV毒株的M蛋白与内质网、高尔基体均存在共定位;M蛋白与G蛋白、M蛋白与N蛋白也存在共定位,但M蛋白与G蛋白主要共定位于内质网、高尔基体上,而M蛋白与N蛋白主要共定位在胞浆中。【结论】RABV M蛋白在胞内主要通过内质网-高尔基体途径合成加工。研究结果明确了RABV M蛋白胞内合成分布部位,为进一步研究RABV病毒粒子的装配和出芽过程丰富了数据。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 M蛋白 内质网 高尔基体

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旋毛虫细胞外囊泡对TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎的初步干预作用 被引量：3

4

作者 刘蕾 杨勇 +4 位作者 高欣 刘晓雷 刘明远 徐凝 白雪 《动物医学进展》 北大核心 2020年第5期67-73,共7页

为探讨旋毛虫细胞外囊泡(Trichinella spiralis extracellular vesicles,Ts-EVs)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠实验性结肠炎的初步干预作用,通过超速离心法获得Ts-EVs,利用透射电子显微镜(TEM)对其进行鉴定。随后将30只Balb/c... 为探讨旋毛虫细胞外囊泡(Trichinella spiralis extracellular vesicles,Ts-EVs)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠实验性结肠炎的初步干预作用,通过超速离心法获得Ts-EVs,利用透射电子显微镜(TEM)对其进行鉴定。随后将30只Balb/c小鼠随机分为正常对照组、TNBS模型组和TNBS+Ts-EVs干预组。通过测定各组小鼠肠道疾病活动指数(DAI)、髓过氧化物酶(MPO)活性和结肠病理组织学变化等指标评价Ts-EVs对结肠炎的干预效果;进一步用ELISA检测外周血血清中细胞因子的表达情况。TEM结果显示,EVs具有膜结构,形态呈圆形或椭圆形,平均直径为30nm^150nm;评估Ts-EVs对TNBS诱导的小鼠结肠炎的干预效果表明,TNBS+Ts-EVs干预组小鼠的结肠炎临床症状有所缓解,炎症指标均明显降低;与TNBS模型组相比,TNBS+Ts-EVs干预组小鼠的Th1细胞因子(IL-1β、IFN-γ)和Th17细胞因子(IL-17A)表达水平均显著降低;而Treg细胞因子(IL-10、TGF-β)表达水平明显升高。研究结果表明Ts-EVs可有效干预TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎,此干预作用可能与调节Th细胞免疫平衡有关。 展开更多

关键词 旋毛虫 细胞外囊泡 2 4 6-三硝基苯磺酸 实验性结肠炎

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旋毛虫赖氨酸乙酰化修饰组学的分析研究 被引量：1

5

作者 刘蕾 杨勇 +5 位作者 高欣 刘晓雷 唐斌 王学林 刘明远 白雪 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期893-898,共6页

目的在组学水平上对食源性寄生虫旋毛虫的蛋白质赖氨酸乙酰化进行分析,为探索赖氨酸乙酰化在旋毛虫成功寄生和免疫逃避中的调控作用提供重要信息。方法通过抗赖氨酸乙酰化抗体富集技术结合高度灵敏的质谱鉴定在组学层面分析旋毛虫蛋白... 目的在组学水平上对食源性寄生虫旋毛虫的蛋白质赖氨酸乙酰化进行分析,为探索赖氨酸乙酰化在旋毛虫成功寄生和免疫逃避中的调控作用提供重要信息。方法通过抗赖氨酸乙酰化抗体富集技术结合高度灵敏的质谱鉴定在组学层面分析旋毛虫蛋白赖氨酸乙酰化程度。结果亲和富集结合液相色谱电喷雾电离串联质谱分析发现1 592种旋毛虫蛋白的3 872赖氨酸位点修饰位点发生乙酰化,这些蛋白参与旋毛虫多种生物过程。功能富集分析发现29个乙酰化蛋白与吞噬作用相关,表明赖氨酸乙酰化在吞噬过程中的重要作用。结论旋毛虫蛋白大量的赖氨酸乙酰化(Kac),本实验为深入研究可逆性Kac在旋毛虫和其他线虫的生长和发育中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 赖氨酸乙酰化 旋毛虫 翻译后修饰

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黑龙江省扶余市麦穗鱼舌状绦虫裂头蚴的分子鉴定和系统发育分析

6

作者 陈秀琴 邱阳元 +4 位作者 郑敏 林甦 江斌 王劭 黄梅清 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第8期74-80,共7页

为鉴定从黑龙江省扶余市麦穗鱼腹腔内收集的绦虫裂头蚴的种类,本试验采用PCR方法分别对其核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行扩增和序列测定。运用DNASTAR软件的MegAlign程序分析核苷酸同源性,采用邻... 为鉴定从黑龙江省扶余市麦穗鱼腹腔内收集的绦虫裂头蚴的种类,本试验采用PCR方法分别对其核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行扩增和序列测定。运用DNASTAR软件的MegAlign程序分析核苷酸同源性,采用邻接法构建基于ITS和COⅠ基因序列的系统进化树,以此分析分离虫株种内与种间的系统发育关系。结果显示,各分离虫株的ITS1和ITS2基因与舌状绦虫(AY121751)的核苷酸序列同源性最高,分别为98.8%~100%和99.6%~99.7%;各分离虫株的COⅠ基因与肠舌状绦虫(EU241273)的核苷酸序列同源性最高,为91.2%~94.7%。基于ITS序列构建的系统进化树显示,舌状绦虫和双线绦虫的ITS序列具有高度的保守性,ITS区域可能不适宜作为区分舌状绦虫属内部种类的可靠分子标记。基于COⅠ基因构建的系统进化树显示,分离虫株与土耳其、俄罗斯和欧洲的肠舌状绦虫分离株进化关系最近。根据序列同源性和COⅠ基因进化树结果,初步将本试验所分离虫株鉴定为肠舌状绦虫。结果表明,COⅠ基因更适合于舌状绦虫属种类的鉴别。本试验为舌状绦虫的分子流行病学调查提供了参考。 展开更多

关键词 舌状绦虫 分子鉴定 系统发育分析 核糖体内转录间隔区 线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ

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鼠伤寒沙门菌重组鞭毛蛋白对巨噬细胞细胞因子与氧化/抗氧化水平的影响 被引量：3

7

作者 王晓利 廖成水 +3 位作者 路霞 崔淹鸽 王安琪 王臣 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期528-533,共6页

为研究重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白对巨噬细胞细胞因子与氧化/抗氧化水平的影响,本研究将50 ng/mL、250 ng/mL和500 ng/mL重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC分别与巨噬细胞J774.1共孵育,分别采用CCK-8法、LDH试剂盒、ELISA试剂盒和荧光显微镜... 为研究重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白对巨噬细胞细胞因子与氧化/抗氧化水平的影响,本研究将50 ng/mL、250 ng/mL和500 ng/mL重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC分别与巨噬细胞J774.1共孵育,分别采用CCK-8法、LDH试剂盒、ELISA试剂盒和荧光显微镜检测巨噬细胞活力、巨噬细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)、巨噬细胞分泌细胞因子和巨噬细胞胞内活性氧(ROS)水平;采用商品化试剂盒检测巨噬细胞产生的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)等氧化/抗氧化水平。结果显示,50 ng/mL重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白对巨噬细胞活力无影响,而巨噬细胞活力在该蛋白浓度为250 ng/mL(12 h)和500 ng/mL(9 h)时明显下降。该重组蛋白对巨噬细胞上清LDH水平的影响随其浓度的增加呈上升趋势,同时该重组蛋白的浓度对巨噬细胞分泌IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和TGF-β的影响也呈正相关趋势。荧光显微镜检测显示,该重组蛋白刺激巨噬细胞胞内ROS水平明显增强。氧化/抗氧化水平方面,该重组蛋白导致巨噬细胞iNOS、MDA和NO氧化水平升高,而GSH-PX、SOD和T-AOC抗氧化水平降低。综上所述,鼠伤寒沙门菌重组鞭毛蛋白能增强巨噬细胞分泌细胞因子,也可引起巨噬细胞氧化/抗氧化平衡失调,为进一步探究鼠伤寒沙门菌与宿主的互作提供参考。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 鞭毛蛋白 巨噬细胞 细胞因子 氧化/抗氧化

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一种包被抗原稳定剂的研制及其特性鉴定 被引量：2

8

作者 张茂林 段铭 +5 位作者 关振宏 单晶辉 卢强 孟锐奇 刘红全 何秀苗 《湖北农业科学》 北大核心 2010年第7期1667-1668,1673,共3页

以纯化的狂犬病病毒2μg/mL包被酶标板,将乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖分别以5%(W/V)的终浓度加到1%BSA+4%PEG的PBS中,所制备的溶液作为封闭剂,研究其对于37℃贮存板的稳定性,从中选取最佳的封闭剂组合,并研究其对于乙肝表面抗原、猪瘟病... 以纯化的狂犬病病毒2μg/mL包被酶标板,将乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖分别以5%(W/V)的终浓度加到1%BSA+4%PEG的PBS中,所制备的溶液作为封闭剂,研究其对于37℃贮存板的稳定性,从中选取最佳的封闭剂组合,并研究其对于乙肝表面抗原、猪瘟病毒E2抗原和猪繁殖与呼吸综合征nsp2基因原核表达产物在包被状态下的稳定性。结果显示,以1%BSA+4%PEG+5%蔗糖的PBS溶液的封闭效果最佳,该封闭剂对于乙肝表面抗原、猪瘟病毒E2抗原和猪繁殖与呼吸综合征nsp2基因原核表达产物也具有良好的稳定性。 展开更多

关键词 抗原 稳定剂 狂犬病病毒 乙肝表面抗原 猪瘟病毒E2蛋白 猪繁殖与呼吸障碍综合征nsp2蛋白

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副猪嗜血杆菌病的诊断与防治 被引量：5

9

作者 杨裕 杨志强 +4 位作者 丁艳霞 李琳 任严新 孙召金 王福传 《中国猪业》 2014年第7期26-29,共4页

副猪嗜血杆菌是健康猪呼吸道携带的一种病原,常于猪只受应激后诱发以多发性浆膜炎、纤维性渗出性炎症、关节炎、脑膜炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的高度接触性传染病,本文综述了HPS的病原特性、流行特点、发病机理、诊断、预防... 副猪嗜血杆菌是健康猪呼吸道携带的一种病原,常于猪只受应激后诱发以多发性浆膜炎、纤维性渗出性炎症、关节炎、脑膜炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的高度接触性传染病,本文综述了HPS的病原特性、流行特点、发病机理、诊断、预防以及治疗,并对该病防控的发展方向进行展望。 展开更多

关键词 副猪嗜血杆菌 病原 流行 防控

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低氧诱导因子-1α在旋毛虫感染过程中的动态变化

10

作者 廖成水 王臣 +8 位作者 王晓利 王安琪 余祖华 郁川 汪洋 李世杰 陈贯超 程相朝 刘明远 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期664-666,共3页

为了解旋毛虫感染过程中血清和膈肌低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的动态变化,本研究将旋毛虫ISS534株经口服感染90只大鼠,并于感染后不同时间各取6只大鼠收集血清和膈肌,采用荧光定量PCR和ELISA方法检测各时间点膈肌HIF-1α mRNA水平和血清... 为了解旋毛虫感染过程中血清和膈肌低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的动态变化,本研究将旋毛虫ISS534株经口服感染90只大鼠,并于感染后不同时间各取6只大鼠收集血清和膈肌,采用荧光定量PCR和ELISA方法检测各时间点膈肌HIF-1α mRNA水平和血清HIF-1α水平。结果显示,旋毛虫发育成成虫至产生新生幼虫期间血清和膈肌HIF-1α含量无明显变化,产生新生幼虫后血清和膈肌HIF-1α水平逐渐升高,而且分别在6d和7 d时HIF-1α含量与感染前相比差异显著(p<0.05),随后呈逐渐上升趋势。血清HIF-1α含量直至9 d达到峰值并保持平稳状态,从14 d开始逐渐下降;而膈肌HIF-1α含量于9 d达到峰值后开始逐渐下降至肌幼虫形成,感染30 d血清和膈肌HIF-1α水平下降至感染前状态。结果表明,HIF-1α水平在旋毛虫感染过程中呈倒V型走势,HIF-1α可能是参与调控旋毛虫感染的重要因子。 展开更多

关键词 旋毛虫 低氧诱导因子-1Α 血清 膈肌 动态变化

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旋毛虫plancitoxin-1-like基因的序列分析与编码蛋白结构预测

11

作者 廖成水 王晓利 +7 位作者 田文静 杨亚东 张梦珂 王安琪 张春杰 刘明远 Boireau Pascal 程相朝 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期218-222,共5页

基因组预测旋毛虫拥有125种庞大的DNase II家族蛋白,但只有plancitoxin-1唯一在C端含有一个保守的DNase II活性位点(HKD基序)。为研究旋毛虫plancitoxin-1基因的序列结构特征,以旋毛虫总RNA为模板进行RT-PCR,获得plancitoxin-1基因的序... 基因组预测旋毛虫拥有125种庞大的DNase II家族蛋白,但只有plancitoxin-1唯一在C端含有一个保守的DNase II活性位点(HKD基序)。为研究旋毛虫plancitoxin-1基因的序列结构特征,以旋毛虫总RNA为模板进行RT-PCR,获得plancitoxin-1基因的序列,并利用生物信息学方法进行系统性分析。结果显示,扩增得到的核苷酸序列比GenBank中相关序列短210bp,编码294个氨基酸,由20种氨基酸组成,重新命名为plancitoxin-1-like,且氨基酸序列中在N端和C端都具有HKD基序。蛋白质理论相对分子质量为33.19ku,等电点为9.17,是稳定存在的亲水性蛋白。Plancitoxin-1-like的氨基酸序列与其他物种DNase II的相似性为35%左右。Plancitoxin-1-like含有4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、31个磷酸化位点、17个B细胞线性结合位点和9个T细胞结合位点以及3个二硫键。二级结构中,α-螺旋占14.29%(42个),延伸链占28.23%(83个),无规卷曲占55.10%(162个)。本研究成功克隆旋毛虫plancitoxin-1-like基因,对其序列结构进行分析,为进一步研究庞大的DNase II家族蛋白在旋毛虫发育和感染中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 旋毛虫 DNASE II 克隆 生物信息学

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黏蛋白在肠道寄生虫感染中的作用 被引量：2

12

作者 苗雅娟 吴秀萍 +2 位作者 王光明 王学林 赵颖 《湖北农业科学》 北大核心 2012年第12期2409-2411,2415,共4页

黏蛋白是由黏膜下腺体或上皮细胞中的黏液分泌的一种高分子蛋白,是一类具有典型黏附性和弹性的糖蛋白。在胃肠道寄生虫感染过程中,黏蛋白作为肠道黏膜屏障的主要组成部分在防御和清除寄生虫感染过程中发挥着重要作用。主要综述了黏蛋白... 黏蛋白是由黏膜下腺体或上皮细胞中的黏液分泌的一种高分子蛋白,是一类具有典型黏附性和弹性的糖蛋白。在胃肠道寄生虫感染过程中,黏蛋白作为肠道黏膜屏障的主要组成部分在防御和清除寄生虫感染过程中发挥着重要作用。主要综述了黏蛋白的结构,糖基化模式以及感染个别肠道寄生虫时,相关的黏蛋白和黏蛋白样分子在宿主的先天性和适应免疫反应中所表现出的生化特性。 展开更多

关键词 黏蛋白 肠道寄生虫 黏蛋白样分子

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利用GST pull-down联合质谱技术鉴定H7N9禽流感病毒PA-X的互作蛋白 被引量：1

13

作者 徐国双 姜童潇 +3 位作者 郭艺迪 段铭 张茂林 关振宏 《广东农业科学》 CAS 2022年第1期121-127,共7页

【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进... 【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进行纯化得到GST-PA-X融合蛋白。利用GST pull-down技术,将GST-PA-X和GST对照蛋白分别与A549细胞裂解液总蛋白进行体外孵育,得到的蛋白复合物经SDS-PAGE分离后进行质谱检测分析。【结果】经GST pull-down筛选与质谱分析鉴定后得到39个高可信度的可能与PA-X互作的候选蛋白质。通过GO注释和KEGG等通路富集分析发现,这些蛋白主要参与RNA的代谢及加工、mRNA翻译及运输、多肽生物合成及基因表达的转录后调节等生物学过程。对其中评分最高的蛋白Hsp70-2与PA-X的相互作用作进一步验证,免疫荧光试验结果表明Hsp70-2与PA-X可以在细胞浆中共定位。【结论】利用GST pulldown联合质谱技术筛选到39种与PA-X互作的候选蛋白,且经免疫荧光试验证明候选蛋白Hsp70-2与PA-X存在共定位,为深入探讨PA-X在AIV生命周期中的作用机制奠定基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒H7N9 PA-X GST pull-down 质谱 Hsp70-2 蛋白互作

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微管对狂犬病病毒胞内感染的影响 被引量：2

14

作者 高洁 赵铭昕 +5 位作者 刘恩华 赵维荣 段铭 关振宏 张茂林 郭艺迪 《湖北农业科学》 2019年第10期121-125,共5页

狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)依赖宿主细胞完成其感染周期,且在胞浆内复制。微管作为一种细胞骨架,是介导胞内物质运输的重要通道。为探究狂犬病病毒胞内感染是否依赖于细胞骨架——微管,利用小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a),接种实验室标... 狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)依赖宿主细胞完成其感染周期,且在胞浆内复制。微管作为一种细胞骨架,是介导胞内物质运输的重要通道。为探究狂犬病病毒胞内感染是否依赖于细胞骨架——微管,利用小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a),接种实验室标准攻击毒株CVS-11,通过诺考达唑(Nocodazole)抑制剂破坏微管形成,采用实时荧光定量PCR方法、WesternBlot方法、免疫荧光方法检测微管对于RABV感染量的影响,并采用TCID50法测定微管对RABV病毒滴度的影响。结果表明,Nocodazole通过抑制微管的形成,使RABVN基因水平降低25%、N蛋白水平降低50%,免疫荧光检测到病毒感染率降低70%,上清液中病毒滴度由106.5TCID50/mL降低至104.5TCID50/mL,说明狂犬病病毒胞内感染依赖于细胞骨架-微管的参与。该结果为进一步研究狂犬病病毒胞内运输及其复制机制的研究提供了理论依据。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 微管 诺考达唑 胞内感染

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miR-15a真核表达载体的构建及鉴定 被引量：1

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作者 张菁 张茂林 +1 位作者 关振宏 段铭 《湖北农业科学》 北大核心 2010年第9期2058-2060,共3页

根据miR-15a成熟体序列合成1对miRNA寡聚单链DNA,克隆到真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-15a真核表达载体。瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经Real-time PCR证明pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-15a能有效表达mi... 根据miR-15a成熟体序列合成1对miRNA寡聚单链DNA,克隆到真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-15a真核表达载体。瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经Real-time PCR证明pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-15a能有效表达miR-15a。试验结果为进一步研究miR-15a的功能和靶基因鉴定打下了基础。 展开更多

关键词 miR-15a 真核表达载体 基因表达

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旋毛虫肌幼虫期外泌体的分离和小RNA鉴定 被引量：6

16

作者 高欣 杨勇 +3 位作者 刘蕾 刘晓雷 刘明远 白雪 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期261-266,共6页

目的分离纯化旋毛虫肌幼虫分泌的外泌体,并进行鉴定,为研究旋毛虫免疫逃逸机制提供新的线索。方法采用超速离心法提取旋毛虫肌幼虫期外泌体,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、免疫印记和小RNA测序对其进行鉴定。结果旋毛虫肌幼虫... 目的分离纯化旋毛虫肌幼虫分泌的外泌体,并进行鉴定,为研究旋毛虫免疫逃逸机制提供新的线索。方法采用超速离心法提取旋毛虫肌幼虫期外泌体,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、免疫印记和小RNA测序对其进行鉴定。结果旋毛虫肌幼虫期外泌体为有膜的泡状物,直径约80~200 nm,表达外泌体特异性标记蛋白CD63和Enolase,含1266个已知的miRNA。结论经形态、粒径及标记蛋白分析证实成功分离旋毛虫肌幼虫期外泌体,同时构建旋毛虫肌幼虫期外泌体的小RNA文库,鉴定出多种功能性小RNA,为深入研究旋毛虫肌幼虫期外泌体内小RNA分子的应用提供数据。 展开更多

关键词 旋毛虫 肌幼虫期 外泌体 MIRNA

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A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

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作者 李俊杰 侯佩莉 关振宏 《湖北农业科学》 北大核心 2010年第4期788-790,797,共4页

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-... 对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 流感病毒 谷胱甘肽硫转移酶-A型流感病毒PB1-F2蛋白融合蛋白 原核表达 纯化

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叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR测定布鲁氏菌活菌数方法的建立 被引量：3

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作者 张士军 常恒祯 +9 位作者 王路鹿 翟菲菲 鞠丹迪 胡盼 卢士英 李岩松 周玉 柳增善 李兆辉 任洪林 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期352-359,共8页

为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PC... 为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10~3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%~2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种方法同时测定两种不同浓度的S2侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,结果显示两种方法测定值虽然均差异显著(p<0.05),但测得的活菌数均在一个数量级且变化趋势一致,并均与侵染的活菌数呈正相关。上述结果表明,本研究建立的PMA-qPCR检测方法可以对布鲁氏菌活菌实现快速定量检测,为布鲁氏菌活菌数测定相关研究提供可行技术。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bcsp31 叠氮溴化丙锭(PMA) 荧光定量PCR 标准曲线

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与RABV感染相关表观遗传修饰酶的筛选

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作者 赵铭昕 赵维荣 +2 位作者 徐婧 郭艺迪 张茂林 《山东农业科学》 2020年第10期157-162,共6页

狂犬病病毒(rabies virus,RABV)作为一种嗜神经性病毒,致死率100%。表观遗传学修饰由多种修饰酶参与,调节多种病毒的感染周期。为筛选与RABV感染相关的表观遗传修饰酶,本研究将实验室标准攻击毒株CVS-11接种于小鼠神经母细胞瘤(N2a),采... 狂犬病病毒(rabies virus,RABV)作为一种嗜神经性病毒,致死率100%。表观遗传学修饰由多种修饰酶参与,调节多种病毒的感染周期。为筛选与RABV感染相关的表观遗传修饰酶,本研究将实验室标准攻击毒株CVS-11接种于小鼠神经母细胞瘤(N2a),采用实时荧光定量PCR技术检测不同时间点表观遗传修饰酶的基因表达水平。结果显示,随RABV感染时间延长,DNA甲基化转移酶DNMT3b,组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC3、HDAC6,组蛋白去甲基化酶PHF8和组蛋白甲基转移酶EZH2、SETDB1、SUV39H1基因表达水平降低。这些变化初步显示,RABV感染导致了细胞功能的激活,为进一步研究调控狂犬病病毒感染的表观遗传学机制提供了基础。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 DNA甲基化转移酶 组蛋白去乙酰化酶 组蛋白去甲基化酶 组蛋白甲基转移酶

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