苯丙酸对蘑菇酪氨酸酶活力的抑制作用 被引量：6

1

作者 郑成已 郭云集 +4 位作者 梁戈 左麒暄 杨美花 孙黎 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期117-120,共4页

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是生物黑色素形成的关键酶,该酶抑制剂在果蔬防褐变保鲜中具有重要的应用前景.在筛选酪氨酸酶活力抑制剂过程中,发现苯丙酸对蘑菇酪氨酸酶活力有明显的抑制作用,对蘑菇防止褐变具有较好的保鲜效果.报道了苯丙酸... 酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是生物黑色素形成的关键酶,该酶抑制剂在果蔬防褐变保鲜中具有重要的应用前景.在筛选酪氨酸酶活力抑制剂过程中,发现苯丙酸对蘑菇酪氨酸酶活力有明显的抑制作用,对蘑菇防止褐变具有较好的保鲜效果.报道了苯丙酸对蘑菇酪氨酸酶单酚酶活力和二酚酶活力的影响和抑制作用.结果表明,苯丙酸对蘑菇酪氨酸酶的单酚酶的效应不仅降低了酶促反应的稳定态活性,也延长了酶促反应的迟滞时间,并具有浓度依赖关系.当苯丙酸浓度达10.0mmol/L时,稳定态活力下降2/3,迟滞时间从100s延长到140s;苯丙酸对二酚酶活力的抑制也显示浓度效应,抑制效果更为显著,引起酶活力下降50%的抑制剂浓度(IC50)为2.05mmol/L,苯丙酸对二酚酶活力的抑制显示可逆的效应,抑制类型为混合型,抑制常数(KI和KIS)分别为1.570和3.070mmol/L. 展开更多

关键词 酪氨酸酶 苯丙酸 单酚酶活力 二酚酶活力 抑制机理

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原儿茶酸对小鼠黑色素瘤B16细胞酪氨酸酶活力及黑色素生成的抑制效应 被引量：11

2

作者 杨美花 石艳 +2 位作者 李智聪 王秋红 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期842-845,共4页

酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的关键酶,其抑制剂有着广泛的应用前景.从天然药物的有效成分中筛选安全的酶抑制剂具有重要意义.以小鼠黑色素瘤B16细胞为模型,研究了天然药物有效成分原儿茶酸对黑色素生成和酪氨酸酶活力的影响.实验结果... 酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的关键酶,其抑制剂有着广泛的应用前景.从天然药物的有效成分中筛选安全的酶抑制剂具有重要意义.以小鼠黑色素瘤B16细胞为模型,研究了天然药物有效成分原儿茶酸对黑色素生成和酪氨酸酶活力的影响.实验结果显示:原儿茶酸可显著降低细胞的黑色素含量,浓度为10μmol/L时使黑色素含量降低60%.进一步研究发现,原儿茶酸对小鼠黑色素瘤B16细胞粗提取和共培养体系中的酪氨酸酶均有较强的抑制作用.对粗提酪氨酸酶的活力半抑制浓度(IC50)约为160μmol/L,与共培养体系中酪氨酸酶活力的抑制、抑制剂浓度和作用时间有关,10μmol/L作用54h可使酪氨酸酶活力下降88%.本研究为原儿茶酸作为酪氨酸酶抑制剂的开发应用奠定了基础. 展开更多

关键词 小鼠黑色素瘤B16细胞(B16细胞) 酪氨酸酶 黑素生成 原儿茶酸

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变性剂对重组牛肠激酶活性的影响 被引量：1

3

作者 陈小兰 杨美花 +3 位作者 李智聪 郑丽钦 孙黎 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期603-606,共4页

肠激酶(EK,EC 3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘胺为底物,采用荧光跟踪法研究了变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对重组牛肠激酶(rEK)活力的影响及抑制动力学.结果表明:盐酸胍... 肠激酶(EK,EC 3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘胺为底物,采用荧光跟踪法研究了变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对重组牛肠激酶(rEK)活力的影响及抑制动力学.结果表明:盐酸胍、硫脲、尿素均对该酶的活性有较强的抑制作用,它们对该酶的半抑制浓度(IC50)分别为0.025,0.080和0.750 mol/L.研究的3种变性剂对该酶的抑制均显示可逆抑制机理;抑制类型也均为竞争性类型,测定它们对酶的抑制常数KI分别为0.015,0.060和0.553 mol/L. 展开更多

关键词 变性剂 重组牛肠激酶 动力学 抑制作用

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效应物对牛肠激酶活性的影响 被引量：2

4

作者 郑丽钦 杨美花 +3 位作者 潘志针 王秋红 孙黎 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期725-728,共4页

肠激酶(EK,EC3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质甘氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-β-萘胺(Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide,GD4K-β-naphthylamide)为底物,采用荧光跟踪... 肠激酶(EK,EC3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质甘氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-β-萘胺(Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide,GD4K-β-naphthylamide)为底物,采用荧光跟踪法研究了不同氨基酸、几种常用有机溶剂、EDTA、DTT等对牛肠激酶(BEK)活力的影响.结果表明:L-赖氨酸(L-Lys)、丙酮、EDTA、DTT对该酶的活性有较强的抑制作用,IC50分别约为25,50,50和120mmol/L.进一步研究了L-Lys与丙酮对BEK活力的抑制机理以及抑制类型,结果表明:L-Lys对该酶的抑制机理为可逆抑制,其抑制类型为竞争型抑制类型,其抑制常数KI为12.02mmol/L.丙酮对BEK的抑制类型表现为不可逆抑制. 展开更多

关键词 L-赖氨酸 牛肠激酶 动力学 抑制作用

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人ω干扰素在毕赤酵母中的表达和纯化 被引量：1

5

作者 蒙翠凤 饶晓璐 +2 位作者 郑成已 王世媛 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期1074-1078,共5页

ω干扰素(IFN-ω)是同IFN-α功能相近但抗原性不同的一类干扰素分子,它具有同IFN-α、IFN-γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用.采用5L发酵罐发酵表达IFN-ω,发酵培养液经超滤膜浓缩、SP层析柱梯度分离,得到糖基化的IFN-ω,... ω干扰素(IFN-ω)是同IFN-α功能相近但抗原性不同的一类干扰素分子,它具有同IFN-α、IFN-γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用.采用5L发酵罐发酵表达IFN-ω,发酵培养液经超滤膜浓缩、SP层析柱梯度分离,得到糖基化的IFN-ω,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-TOF MS)和N端蛋白序列分析仪分析其分子质量和N端序列,用细胞病变抑制法测定活性.结果表明,诱导约48h时,目的蛋白表达量最高,通过SP梯度洗脱,可将糖基化和非糖基化的IFN-ω分离,质谱分析糖基化蛋白样品,质谱峰为糖基化蛋白特有的峰.纯化后糖基化的IFN-ω抗病毒活性为1.46×108 U/mL. 展开更多

关键词 IFN—ω 表达 纯化 N端测序 活性测定

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重组人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 被引量：1

6

作者 林辉煌 刘春凤 +2 位作者 尹凤红 丁玉梅 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期836-841,共6页

采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主,通过300L发酵罐进行中试发酵表达重组人白细胞介素-13(rhIL-13)融合蛋白;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,离心发酵液收集菌体,菌体经溶解、变性、稀释复性及亲和层析捕获,获得融合蛋... 采用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主,通过300L发酵罐进行中试发酵表达重组人白细胞介素-13(rhIL-13)融合蛋白;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,离心发酵液收集菌体,菌体经溶解、变性、稀释复性及亲和层析捕获,获得融合蛋白;融合蛋白经肠激酶酶切后,再经亲和层析分离和分子筛精细纯化等步骤,获得高纯度rhIL-13原液.每升发酵液可获得高纯度的rhIL-13原液约30mg.通过本纯化工艺获得的rhIL-13原液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测,纯度大于98.75%;经高效液相色谱分子排阻(HPLC-SEC)法检测,纯度为100%;质谱(MS)法测定rhIL-13分子质量为12 348u,与理论值基本一致;采用噻唑蓝(MTT)法进行比活性检测,比活大于8.0×106 IU/mg;采用HPLC-SEC法和MS法对rhIL-13二硫键数目和位置进行分析,结果显示二硫键数目和位置与理论一致.此操作方法可获得高纯度、高活性的rhIL-13原液,并且操作简单,易于放大,可实现工业化规模生产. 展开更多

关键词 重组人白细胞介素-13(rhIL-13) 表达 纯化 鉴定

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超氧化物歧化酶经谷胱甘肽和Y型聚乙二醇共修饰后的性质研究 被引量：1

7

作者 雷利芳 杨美花 +3 位作者 许鑫琦 裴广强 刘春凤 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期31-35,共5页

使用谷胱甘肽(GSH)和40ku-Y型聚乙二醇(PEG)作为修饰剂,对超氧化物歧化酶(SOD)进行2次修饰,获得了GSH和PEG共修饰的超氧化物歧化酶(PEG-GSOD).分别测定PEG-GSOD与普通SOD的热稳定性、抗胰酶稳定性、抗变性剂稳定性等,并进行比较研究,结... 使用谷胱甘肽(GSH)和40ku-Y型聚乙二醇(PEG)作为修饰剂,对超氧化物歧化酶(SOD)进行2次修饰,获得了GSH和PEG共修饰的超氧化物歧化酶(PEG-GSOD).分别测定PEG-GSOD与普通SOD的热稳定性、抗胰酶稳定性、抗变性剂稳定性等,并进行比较研究,结果显示:PEG-GSOD比普通SOD(没有修饰的)在热、抗胰酶、抗变性剂等方面的稳定性均有明显提高;通过新西兰兔的体内实验,将PEG-GSOD和普通SOD分别对新西兰兔静脉注射,普通SOD注射0.5h后,SOD酶活性降低至0,而PEG及GSH联合修饰的PEG-GSOD,注射48h后,血浆SOD活性检测还保留约75%,注射72h后,酶活力保留约40%,测得PEG-GSOD在新西兰兔体内半衰期约为50h.此结果说明,PEG-GSOD,其在体内的半衰期显著延长,稳定更好,该研究为SOD药物的应用奠定了基础. 展开更多

关键词 谷胱甘肽 聚乙二醇 超氧化物歧化酶 修饰 稳定性

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重组人表皮生长因子在毕赤酵母中的表达纯化及鉴定 被引量：2

8

作者 廖小金 肖清江 +2 位作者 庄露 周卫东 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期855-859,共5页

构建并筛选出重组人表皮生长因子（rhEGF）高表达的毕赤酵母（Pichia pastoris）基因工程菌株,于30L发酵罐进行中试发酵按1∶15接种15LFBSM发酵,pH 6.0、28~30℃、DO20%~30%、流加甲醇诱导发酵42h,rhEGF的表达量可达1g/L.采用疏水层析... 构建并筛选出重组人表皮生长因子（rhEGF）高表达的毕赤酵母（Pichia pastoris）基因工程菌株,于30L发酵罐进行中试发酵按1∶15接种15LFBSM发酵,pH 6.0、28~30℃、DO20%~30%、流加甲醇诱导发酵42h,rhEGF的表达量可达1g/L.采用疏水层析、离子交换柱层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化rhEGF,获得的rhEGF试制品的纯度大于95%,得率在40%以上.通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定rhEGF的分子质量为5 946.309u,与理论分子质量一致.N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列,测序结果与理论的氨基酸序列一致.采用Balb/c 3T3细胞增殖/MTT比色法测定其活性,测定rhEGF的活性为1.0×106 IU/mg,与WHO标准品相当.本研究实现了毕赤酵母高效表达rhEGF并纯化得到符合《中国药典》标准的rhEGF,为工业化生产rhEGF提供基础. 展开更多

关键词 表皮生长因子(EGF) 表达 纯化

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液质联用研究人重组干细胞因子一级结构

9

作者 郑建华 张平 +2 位作者 饶晓璐 王世媛 颜江华 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期612-616,共5页

通过高效液相色谱(HPLC)和质谱技术,对人重组干细胞因子(rhSCF)分子进行分析,以确证其一级结构.将rh-SCF样品胰酶酶切,HPLC-RPC分离,基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF-MS)对rhSCF的酶切肽段进行解析,并对rhSCF的O-... 通过高效液相色谱(HPLC)和质谱技术,对人重组干细胞因子(rhSCF)分子进行分析,以确证其一级结构.将rh-SCF样品胰酶酶切,HPLC-RPC分离,基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF-MS)对rhSCF的酶切肽段进行解析,并对rhSCF的O-糖基化和N-糖基化位点进行了分析.结果:(1)rhSCF分子质量得到测定;(2)rhSCF的一级结构得到确认,测定的肽质量谱的覆盖率达到94%,分子中有两对二硫键;(3)鉴定了样品中的N-糖基化位点,并对rhSCF产品的O-及N-连接糖型上的糖结构进行初步探讨.结果显示:rhSCF一级氨基酸序列和二硫键形成位置与理论上一致,糖基化特性符合毕赤酵母表达蛋白的糖基化特点. 展开更多

关键词 MALDI-TOF-MS 人重组干细胞因子 二硫键 糖基化

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重组人转化生长因子β1在CHO/dhfr^-细胞中的稳定表达和纯化

10

作者 刘春凤 张宁 +2 位作者 周婷 王世媛 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期67-71,共5页

构建了含重组人转化生长因子β1(rhTGF-β1)基因的真核表达载体,并利用阳离子脂质体介导的方法,将构建的表达载体转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型哺乳动物细胞CHO/dhfr-中,通过氨甲喋呤(MTX)加压筛选获得稳定表达重组人转化生长因子β... 构建了含重组人转化生长因子β1(rhTGF-β1)基因的真核表达载体,并利用阳离子脂质体介导的方法,将构建的表达载体转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型哺乳动物细胞CHO/dhfr-中,通过氨甲喋呤(MTX)加压筛选获得稳定表达重组人转化生长因子β1的细胞株.于14L细胞发酵罐进行扩大培养,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测得表达量在3mg/L左右.采用亲和层析、反相层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化,获得的rhTGF-β1试制品的纯度大于97%,得率在25%以上.通过基质辅助激光解析电离化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定rhTGF-β1的分子量为25.470ku,与理论分子量一致.N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列,与理论的氨基酸序列一致.rhTGF-β1具有抑制水貂肺上皮细胞Mv-1-Lu增殖的活性,测定其比活为3.2×107 IU/mg,与商品化的rhTGF-β1标准品相当.本研究为进一步规模化制备rhTGF-β1奠定了基础. 展开更多

关键词 重组人转化生长因子β1 表达 纯化

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重组人胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定

11

作者 尹凤红 肖清江 +1 位作者 周卫东 陈清西 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期192-197,共6页

采用大肠杆菌作为宿主表达重组人胸腺肽α1(rhTα1)融合蛋白,纯化获得rhTα1并对其鉴定.于300L发酵罐进行中试发酵表达rhTα1融合蛋白;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,离心发酵液收集菌体,菌体经破碎、离心、亲和层析捕获,... 采用大肠杆菌作为宿主表达重组人胸腺肽α1(rhTα1)融合蛋白,纯化获得rhTα1并对其鉴定.于300L发酵罐进行中试发酵表达rhTα1融合蛋白;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导,离心发酵液收集菌体,菌体经破碎、离心、亲和层析捕获,获得融合蛋白;每升发酵液可获得约170 mg硫氧环蛋白-胸腺肽α1融合蛋白.融合蛋白经肠激酶酶切后,再经亲和层析、反相层析、体积排阻层析等纯化步骤,获得高纯度rhTα1;通过本纯化工艺获得的rhTα1原液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效液相色谱-排阻法(HPLC-SEC)的检测纯度均大于99%;采用玫瑰花环形成率测定rhTα1活性与市售化学合成标准品一致;质谱分析分子质量为3 066.59u,与去乙酰化的rhTα1理论分子质量(3 066u)一致;N端测序结果与理论值一致.综上结果,说明本工艺可实现工业化规模生产. 展开更多

关键词 重组人胸腺肽α1(rhTα1) 表达 纯化

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