目的:研究泛素特异性蛋白酶35(ubiquitin-specific protease 35,USP35)对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis-fibroblast like synoviocytes,RA-FLS)铁死亡的作用及机制,加深对RA发病机制的理解,并为其治疗提供潜在的...目的:研究泛素特异性蛋白酶35(ubiquitin-specific protease 35,USP35)对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis-fibroblast like synoviocytes,RA-FLS)铁死亡的作用及机制,加深对RA发病机制的理解,并为其治疗提供潜在的标靶。方法:(1)体外培养RA-FLS,用慢病毒载体感染以构建稳定敲低USP35的细胞系(short hairpin ribonucleic acid of USP35,shUSP35)和其对照细胞系(negtive control of short hairpin ribonucleic acid,shNC),以及稳定过表达USP35的细胞系(overexpression of USP35,USP35 OE)和其对照细胞系(Vector)。为了探究USP35在铁死亡调控中的作用,使用1μmol/L依拉司亭(Erastin)诱导RA-FLS细胞构建铁死亡模型。将细胞分为6组,第一组是shNC细胞,第二组是用Erastin处理shNC细胞(shNC+Erastin),第三组是用Erastin处理shUSP35细胞(shUSP35+Erastin),第四组是Vector细胞,第五组是用Erastin处理Vector细胞(Vector+Erastin),第六组是用Erastin处理USP35 OE细胞(USP35 OE+Erastin)。(2)采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK8)检测细胞活力;(3)分别使用活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(glutathione sulfide,GSSG)检测试剂盒、亚铁离子含量检测试剂盒检测细胞中ROS、MDA、Fe ^(2+)的含量以及GSH/GSSG比值;(4)采用蛋白免疫印迹实验(Western blotting)检测溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白的表达水平。结果:(1)与shNC+Erastin组相比,shUSP35+Erastin组的RA-FLS细胞活力显著降低(P<0.001),而与Vector+Erastin组相比,USP35 OE+Erastin组的细胞活力显著升高(P<0.001),表明USP35可显著缓解Erastin对RA-FLS细胞活力的抑制作用。(2)与shNC+Erastin组相比,shUSP35+Erastin组细胞的ROS(P<0.001)、MDA(P<0.05)和Fe ^(2+)水平(P<0.001)显著升高,GSH/GSSG比值显著增加(P<0.05);而与Vector+Erastin组相比,USP35OE+Erastin组细胞的ROS(P<0.001)、MDA(P<0.05)和Fe ^(2+)水平(P<0.05)显著降低,GSH/GSSG比值显著下降(P<0.05),表明USP35可显著抑制Erastin诱导的RA-FLS细胞氧化应激和脂质过氧化。(3)在Erastin诱导的RA-FLS中,USP35的表达与SLC7A11和GPX4蛋白水平呈正相关。结论:USP35抑制RA-FLS的铁死亡,可能与增加SLC7A11和GPX4表达相关。展开更多
文摘目的:研究泛素特异性蛋白酶35(ubiquitin-specific protease 35,USP35)对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis-fibroblast like synoviocytes,RA-FLS)铁死亡的作用及机制,加深对RA发病机制的理解,并为其治疗提供潜在的标靶。方法:(1)体外培养RA-FLS,用慢病毒载体感染以构建稳定敲低USP35的细胞系(short hairpin ribonucleic acid of USP35,shUSP35)和其对照细胞系(negtive control of short hairpin ribonucleic acid,shNC),以及稳定过表达USP35的细胞系(overexpression of USP35,USP35 OE)和其对照细胞系(Vector)。为了探究USP35在铁死亡调控中的作用,使用1μmol/L依拉司亭(Erastin)诱导RA-FLS细胞构建铁死亡模型。将细胞分为6组,第一组是shNC细胞,第二组是用Erastin处理shNC细胞(shNC+Erastin),第三组是用Erastin处理shUSP35细胞(shUSP35+Erastin),第四组是Vector细胞,第五组是用Erastin处理Vector细胞(Vector+Erastin),第六组是用Erastin处理USP35 OE细胞(USP35 OE+Erastin)。(2)采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK8)检测细胞活力;(3)分别使用活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(glutathione sulfide,GSSG)检测试剂盒、亚铁离子含量检测试剂盒检测细胞中ROS、MDA、Fe ^(2+)的含量以及GSH/GSSG比值;(4)采用蛋白免疫印迹实验(Western blotting)检测溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白的表达水平。结果:(1)与shNC+Erastin组相比,shUSP35+Erastin组的RA-FLS细胞活力显著降低(P<0.001),而与Vector+Erastin组相比,USP35 OE+Erastin组的细胞活力显著升高(P<0.001),表明USP35可显著缓解Erastin对RA-FLS细胞活力的抑制作用。(2)与shNC+Erastin组相比,shUSP35+Erastin组细胞的ROS(P<0.001)、MDA(P<0.05)和Fe ^(2+)水平(P<0.001)显著升高,GSH/GSSG比值显著增加(P<0.05);而与Vector+Erastin组相比,USP35OE+Erastin组细胞的ROS(P<0.001)、MDA(P<0.05)和Fe ^(2+)水平(P<0.05)显著降低,GSH/GSSG比值显著下降(P<0.05),表明USP35可显著抑制Erastin诱导的RA-FLS细胞氧化应激和脂质过氧化。(3)在Erastin诱导的RA-FLS中,USP35的表达与SLC7A11和GPX4蛋白水平呈正相关。结论:USP35抑制RA-FLS的铁死亡,可能与增加SLC7A11和GPX4表达相关。
