为了探寻利用复合酶制备低聚甘露糖的最佳工艺,基于β-甘露聚糖酶和β-1,4-内切葡聚糖酶对魔芋精粉的水解具有协同作用的原理,以耐高温的重组β-甘露聚糖酶(re Au Man5AN3C3)为主,辅以不同活性单位的高催化活性的重组β-1,4-内切葡聚糖...为了探寻利用复合酶制备低聚甘露糖的最佳工艺,基于β-甘露聚糖酶和β-1,4-内切葡聚糖酶对魔芋精粉的水解具有协同作用的原理,以耐高温的重组β-甘露聚糖酶(re Au Man5AN3C3)为主,辅以不同活性单位的高催化活性的重组β-1,4-内切葡聚糖酶(re Au Cel12A)对魔芋精粉进行水解。通过研究不同酶的添加比例、酶解p H值、酶解时间、酶解温度和底物浓度等因素,获得复合酶最佳的复配比例及酶解工艺条件。同时研究了保护剂对复合酶稳定性的影响。研究结果表明:复合酶解魔芋精粉制备低聚甘露糖的最佳工艺条件为:用去离子水配制的30 g/L魔芋胶溶液,re Au Man5AN3C3和re Au Cel12A配比为1∶1.5(前者为60 U/g魔芋精粉),水解温度为60℃,水解时间为6 h,在此条件下魔芋精粉的水解率可达65%。薄层层析分析结果显示魔芋精粉经酶水解后产物主要是二糖以上的寡糖,且主要介于二糖与六糖之间,无单糖的产生。在有保护剂存在的情况下,复合酶在室温下存放2个月其残余酶活均能超过85%。展开更多
甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类,能催化甲酸氧化生成二氧化碳,同时能将氧化型辅酶I(Oxdized form of nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)还原成还原型辅酶I(Redued form of nicotinamide adenine d...甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类,能催化甲酸氧化生成二氧化碳,同时能将氧化型辅酶I(Oxdized form of nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)还原成还原型辅酶I(Redued form of nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),在NADH的再生中起重要作用。为了获得高活性的甲酸脱氢酶突变体,本研究以博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶(Candida boidinii formate dehydrogenases,CbFDH)突变体(CbFDHC23S)为亲本,进行了2轮定向进化,获得了一个比酶活性约为亲本4倍,且更适合于在生理条件下进行辅酶再生的突变体M2。然后,利用计算机辅助的手段初步阐明了其温度特性和催化效率改变的分子机制。最后,借助共表达策略进一步提高了突变体M2在大肠杆菌中的表达水平,超声裂解液中的甲酸脱氢酶活性达到45.85 U/mL,远远高于亲本单拷贝表达水平。本研究为增强NADH再生能力、降低NADH的再生成本,实现FDH偶联催化的手性醇及氨基酸衍生物等食品添加剂高效、廉价的绿色生物合成奠定理论基础。展开更多
文摘为了获得性能优良的新型β-甘露聚糖酶,本研究采用基因挖掘技术从米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组中挖掘到了2个假定的新型GH5家族β-甘露聚糖酶基因,分别命名为Aoman5A和Aoman5B。对这两条序列做了相关的生物信息学分析,同时借助p PIC9KM质粒将两个酶的成熟肽编码基因在Pichia pastoris GS115中实现了表达,并对表达产物进行了纯化和鉴定。生物信息学分析的结果表明Ao Man5A含有20个氨基酸残基的信号肽,而Ao Man5B含有21个氨基酸残基的信号肽和12个氨基酸残基的前导肽;序列比对的结果显示两个酶与目前已报道的序列最高的同源性分别为68%和79%,且Ao Man5A的N端还携带有一个1家族的CBM;三维结构预测的结果显示,两者均符合(α/β)8的TIM-桶状结构。表达鉴定的结果表明,在同样表达条件下,re Ao Man5A和re Ao Man5B上清液的酶活力分别为2.9、12.5 IU/m L;纯化后它们的酶比活力分别为8.3、104.2 IU/mg,前者的最适温度为35℃,而后者的最适温度为50℃,p H值特性的测定结果表明这两种酶均为酸性酶。硫酸-苯酚法测得re Ao Man5A和re Ao Man5B的糖含量分别为25.4%和12.6%,表明这两种重组酶均经过了糖基化修饰。本研究获得了两种新型的β-甘露聚糖酶,比较分析了它们的序列特征,并实现了它们的异源表达,为β-甘露聚糖酶的进一步研究及应用奠定了坚实的基础,也为其他新型酶的基因挖掘提供了可资借鉴的经验。
文摘为了探寻利用复合酶制备低聚甘露糖的最佳工艺,基于β-甘露聚糖酶和β-1,4-内切葡聚糖酶对魔芋精粉的水解具有协同作用的原理,以耐高温的重组β-甘露聚糖酶(re Au Man5AN3C3)为主,辅以不同活性单位的高催化活性的重组β-1,4-内切葡聚糖酶(re Au Cel12A)对魔芋精粉进行水解。通过研究不同酶的添加比例、酶解p H值、酶解时间、酶解温度和底物浓度等因素,获得复合酶最佳的复配比例及酶解工艺条件。同时研究了保护剂对复合酶稳定性的影响。研究结果表明:复合酶解魔芋精粉制备低聚甘露糖的最佳工艺条件为:用去离子水配制的30 g/L魔芋胶溶液,re Au Man5AN3C3和re Au Cel12A配比为1∶1.5(前者为60 U/g魔芋精粉),水解温度为60℃,水解时间为6 h,在此条件下魔芋精粉的水解率可达65%。薄层层析分析结果显示魔芋精粉经酶水解后产物主要是二糖以上的寡糖,且主要介于二糖与六糖之间,无单糖的产生。在有保护剂存在的情况下,复合酶在室温下存放2个月其残余酶活均能超过85%。
文摘甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类,能催化甲酸氧化生成二氧化碳,同时能将氧化型辅酶I(Oxdized form of nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)还原成还原型辅酶I(Redued form of nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),在NADH的再生中起重要作用。为了获得高活性的甲酸脱氢酶突变体,本研究以博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶(Candida boidinii formate dehydrogenases,CbFDH)突变体(CbFDHC23S)为亲本,进行了2轮定向进化,获得了一个比酶活性约为亲本4倍,且更适合于在生理条件下进行辅酶再生的突变体M2。然后,利用计算机辅助的手段初步阐明了其温度特性和催化效率改变的分子机制。最后,借助共表达策略进一步提高了突变体M2在大肠杆菌中的表达水平,超声裂解液中的甲酸脱氢酶活性达到45.85 U/mL,远远高于亲本单拷贝表达水平。本研究为增强NADH再生能力、降低NADH的再生成本,实现FDH偶联催化的手性醇及氨基酸衍生物等食品添加剂高效、廉价的绿色生物合成奠定理论基础。
