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非小细胞肺癌细胞系PC-9耐药突变细胞株的建立及其对EGFR抑制剂的敏感性验证
1
作者
胡涛
楼洋
苏明波
《中国肺癌杂志》
CSCD
北大核心
2024年第11期815-825,共11页
背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)激酶结构域的突变是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的关键发病因素,小分子EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)是治疗EGFR突...
背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)激酶结构域的突变是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的关键发病因素,小分子EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)是治疗EGFR突变NSCLC的一线药物,而EGFR的耐药突变限制了EGFR-TKIs的临床应用。本研究旨在利用簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)基因敲入技术,构建贴近临床的具有EGFRD19/T790M/C797S突变类型的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞模型,用于研究小分子EGFR-TKIs的抑制作用及为新一代靶向EGFR突变耐药的创新药物研发提供细胞载体。方法利用CRISPR/Cas9技术在EGFRD19突变类型的人NSCLC细胞PC-9上敲入EGFRT790M/C797S突变片段,构建具有EGFRD19/T790M/C797S突变类型的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞模型,以MTS法验证EGFR-TKIs对其增殖抑制作用,以Western blot证明EGFR蛋白表达以及下游蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化调控。结果成功构建EGFRD19/T790M/C797S突变的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞株,在增殖抑制上,已上市的第一、第二及第三代对EGFRD19/T790M/C797S突变无效的EGFR-TKIs对该细胞株的增殖抑制活性均较弱,增殖抑制半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值均大于1000 nmol/L,而对EGFRD19/T790M/C797S突变具有较好疗效的在研的第四代EGFR-TKIs对该细胞模型具有较强的增殖抑制作用;在机制验证上,第一代、第二和第三代EGFR-TKIs对该细胞株EGFR及下游AKT/MAPK信号通路的磷酸化抑制活性均弱,而在研第四代EGFR-TKIs可显著抑制该细胞株EGFR及下游AKT/MAPK信号通路的磷酸化。结论利用CRISPR/Cas9技术在PC-9细胞上敲入EGFRT790M/C797S突变片段成功构建含EGFRD19/T790M/C797S突变的细胞株,并验证其对EGFRD19/T790M/C797S突变是否有效的EGFR-TKIs表现出不同的敏感性且对EGFR及下游通路磷酸化表现出不同的抑制作用,证明该细胞株依赖EGFRD19/T790M/C797S突变及EGFR/AKT/MAPK信号通路的激活进行增殖。本研究为新一代靶向EGFR突变耐药的创新药物研发提供了贴近临床的细胞水平的活性评价和机制验证体系。
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关键词
肺肿瘤
CRISPR/Cas9技术
EGFR突变
EGFR抑制剂
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职称材料
题名
非小细胞肺癌细胞系PC-9耐药突变细胞株的建立及其对EGFR抑制剂的敏感性验证
1
作者
胡涛
楼洋
苏明波
机构
安徽中
医药
大学药学院
长三角药物高等研究院
南通弘烨医药科技有限公司
出处
《中国肺癌杂志》
CSCD
北大核心
2024年第11期815-825,共11页
文摘
背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)激酶结构域的突变是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的关键发病因素,小分子EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)是治疗EGFR突变NSCLC的一线药物,而EGFR的耐药突变限制了EGFR-TKIs的临床应用。本研究旨在利用簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)基因敲入技术,构建贴近临床的具有EGFRD19/T790M/C797S突变类型的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞模型,用于研究小分子EGFR-TKIs的抑制作用及为新一代靶向EGFR突变耐药的创新药物研发提供细胞载体。方法利用CRISPR/Cas9技术在EGFRD19突变类型的人NSCLC细胞PC-9上敲入EGFRT790M/C797S突变片段,构建具有EGFRD19/T790M/C797S突变类型的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞模型,以MTS法验证EGFR-TKIs对其增殖抑制作用,以Western blot证明EGFR蛋白表达以及下游蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化调控。结果成功构建EGFRD19/T790M/C797S突变的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞株,在增殖抑制上,已上市的第一、第二及第三代对EGFRD19/T790M/C797S突变无效的EGFR-TKIs对该细胞株的增殖抑制活性均较弱,增殖抑制半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值均大于1000 nmol/L,而对EGFRD19/T790M/C797S突变具有较好疗效的在研的第四代EGFR-TKIs对该细胞模型具有较强的增殖抑制作用;在机制验证上,第一代、第二和第三代EGFR-TKIs对该细胞株EGFR及下游AKT/MAPK信号通路的磷酸化抑制活性均弱,而在研第四代EGFR-TKIs可显著抑制该细胞株EGFR及下游AKT/MAPK信号通路的磷酸化。结论利用CRISPR/Cas9技术在PC-9细胞上敲入EGFRT790M/C797S突变片段成功构建含EGFRD19/T790M/C797S突变的细胞株,并验证其对EGFRD19/T790M/C797S突变是否有效的EGFR-TKIs表现出不同的敏感性且对EGFR及下游通路磷酸化表现出不同的抑制作用,证明该细胞株依赖EGFRD19/T790M/C797S突变及EGFR/AKT/MAPK信号通路的激活进行增殖。本研究为新一代靶向EGFR突变耐药的创新药物研发提供了贴近临床的细胞水平的活性评价和机制验证体系。
关键词
肺肿瘤
CRISPR/Cas9技术
EGFR突变
EGFR抑制剂
Keywords
Lung neoplasms
CRISPR/Cas9 technology
EGFR mutation
EGFR inhibitors
分类号
R734.2 [医药卫生—肿瘤]
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作者
出处
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1
非小细胞肺癌细胞系PC-9耐药突变细胞株的建立及其对EGFR抑制剂的敏感性验证
胡涛
楼洋
苏明波
《中国肺癌杂志》
CSCD
北大核心
2024
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