猴痘病毒A5L蛋白的原核表达及其免疫原性评价 被引量：2

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作者 熊嘉琦 贾梦乐 +6 位作者 杨领弟 王毅豪 孙静婷 王婷 黎美凤 孔令保 彭棋 《中国畜牧兽医》 CSCD 北大核心 2024年第1期365-372,共8页

【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过... 【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过分析不同IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间条件下重组蛋白A5L表达情况,筛选最佳表达条件。通过Western blotting鉴定重组蛋白A5L表达,利用SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性。A5L蛋白经His-Bind镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,通过ELISA法检测抗体效价。【结果】双酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-28a-A5L构建成功。Western blotting结果显示重组蛋白A5L在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达;A5L蛋白在诱导温度42℃、诱导剂(IPTG)浓度为1.6 mmol/L、诱导16 h后表达量最高,大小为40 ku。SDS-PAGE分析结果显示,A5L蛋白主要以包涵体形式存在,最佳咪唑洗脱浓度为50 mmol/L。ELISA结果显示,制备的鼠抗A5L蛋白抗体最高效价达1∶205 440。【结论】本研究成功构建了重组质粒pET-28a-A5L,并在原核表达系统中成功表达重组蛋白A5L,制备的A5L多克隆抗体具有较好的免疫原性,研究结果为进一步探究MPXV A5L蛋白的生物学功能奠定基础。 展开更多

关键词 猴痘病毒 原核表达 A5L蛋白 免疫原性

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猴痘病毒B20R蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：5

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作者 杨领弟 李小梅 +3 位作者 芦晓鸥 彭棋 孔令保 王宇 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期217-225,共9页

【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序... 【目的】构建猴痘病毒B20R蛋白原核表达系统,并评价原核表达获得的融合蛋白免疫原性,为后续的猴痘病毒检测及新型治疗方法开发提供技术支撑。【方法】参照GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列,按照大肠杆菌密码子偏好性对B20R基因DNA序列进行优化,人工合成B20R基因并将其分别克隆至表达载体pET-28a和pET-32a以构建原核表达载体;以构建的2种原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后使用SDSPAGE和Western blotting检测融合蛋白B20R的表达情况。通过控制变量法优化融合蛋白B20R的诱导表达条件,使用Ni柱亲和层析进行纯化;以纯化的融合蛋白B20R经腹腔注射免疫昆明小鼠,定期采集昆明小鼠血样,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】将B20R基因克隆至表达载体pET-32a能成功构建原核表达载体pET-32a-B20R,经IPTG诱导后,可在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达出融合蛋白B20R,且主要以不可溶的包涵体形式进行表达。融合蛋白B20R最佳诱导表达条件为37℃下以0.6 mmol/L IPTG诱导12 h,Ni柱亲和层析纯化的最佳咪唑洗脱浓度为40 mmol/L。以纯化的融合蛋白B20R接种免疫昆明小鼠,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫,且至免疫第42 d仍然维持较高的抗体水平,抗体效价高达1∶409600。【结论】构建的猴痘病毒B20R蛋白原核表达载体可在大肠杆菌BL21细胞中以包涵体形式成功表达出融合蛋白B20R,且融合蛋白B20R具有良好的免疫原性,可在短时间内引起昆明小鼠产生强烈的体液免疫。 展开更多

关键词 猴痘病毒 B20R蛋白 原核表达 免疫原性 抗体效价

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非洲猪瘟病毒p30生物信息学分析及多克隆抗体的制备

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作者 陈春龙 张丽荣 孔令保 《生物灾害科学》 2024年第4期524-535,共12页

【目的】目前国内流行的变异非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)表现出毒力低,传染性强,隐蔽性强的特点,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床表现不明显,早期诊断难度大,快速灵敏的早期诊断试剂盒对于非洲猪瘟防控至关重... 【目的】目前国内流行的变异非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)表现出毒力低,传染性强,隐蔽性强的特点,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床表现不明显,早期诊断难度大,快速灵敏的早期诊断试剂盒对于非洲猪瘟防控至关重要,而p30的研究及其多克隆抗体的制备可以为早期诊断试剂盒的开发提供重要的理论依据。【方法】根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离的非洲猪瘟毒株Pig/Heilongjiang/HRB1/2020(GenBank:MW656282)提供的p30的氨基酸序列,利用生物信息学软件对该序列的理化性质,亲/疏水性,跨膜区,信号肽及二三级结构进行分析预测,由生物公司优化密码子并合成重组质粒pET-28a-p30。将p30克隆到pET-32a(+)原核表达载体中,将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,对异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导温度及诱导时间进行优化,用纯化所得的p30蛋白对小鼠进行3次免疫,获取多克隆抗体并检测效价。【结果】由生物信息学分析结果得出p30蛋白含194个氨基酸,分子式为C_(1001)H_(1575)N_(259)O_(308)S_(7),p30蛋白为亲水性蛋白,不含跨膜区,无信号肽,二三级结构中含大量的α-螺旋。蛋白表达结果显示,当诱导时间为6 h,IPTG终浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为34℃时,p30重组蛋白表达量达到最佳,浓度高达0.9 mg/mL以上,1 L菌液可产53 mg重组蛋白。通过间接ELISA测得小鼠血清抗体效价高达1:10000000。Western Blotting结果显示,制备的p30蛋白具有较好的特异性。【结论】经过表达优化p30蛋白产量得到明显提高,并获得效价较高的多克隆抗体,且具有很好的特异性。对研发针对p30更加灵敏的诊断试剂盒提供了重要的理论依据。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白 生物信息学分析 原核表达 多克隆抗体

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SARS-CoV-2 Omicron突变株N蛋白的原核表达、纯化及免疫原性研究

4

作者 屠泽文 王全胜 +9 位作者 刘仕国 刘浩森 曾春燕 谢娟娟 李名志 李精彩 王敏 翁诗琦 康路妹 孔令保 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第8期735-743,共9页

目的旨在研究新型冠状病毒Omicron(BA.1、BA.2)N蛋白的免疫学功能,并评估不同新冠病毒突变株N蛋白的免疫原性差异。方法运用序列比对确定Omicron(BA.1、BA.2)N蛋白相对新冠病毒原型株(Wuhan-Hu-1)的突变位点,以pET-28a-N-Wuhan-Hu-1质... 目的旨在研究新型冠状病毒Omicron(BA.1、BA.2)N蛋白的免疫学功能,并评估不同新冠病毒突变株N蛋白的免疫原性差异。方法运用序列比对确定Omicron(BA.1、BA.2)N蛋白相对新冠病毒原型株(Wuhan-Hu-1)的突变位点,以pET-28a-N-Wuhan-Hu-1质粒为模板经单点突变或同源重组构建pET-28a-BA.1/BA.2-N。利用原核系统分别表达上述三种N蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠。运用间接ELISA和Western blot法检测多克隆抗体的效价和反应性以及免疫小鼠脾脏细胞中白细胞介素1β(IL-1β)和γ干扰素(IFN-γ)的表达水平。结果成功利用构建的原核表达质粒在E.coli BL21(DE3)中表达了Wuhan-Hu-1 N、BA.1 N和BA.2 N蛋白,表达条件为37℃,4 h。间接ELISA试验测得三种N蛋白制备的多克隆抗体效价均为1∶51200。三种N蛋白均可使IFN-γ和IL-1β两种细胞因子表达升高,但是Omicron N蛋白较Wuhan-Hu-1 N蛋白激活两种细胞因子的效果更为明显。结论研究获得了三种新冠病毒N蛋白及多克隆抗体,并证实了N蛋白发生氨基酸位点的突变会对其免疫原性产生影响。这为开发针对不同新冠变异株N蛋白的快速诊断方法提供了依据。 展开更多

关键词 多克隆抗体 Omicron 核衣壳蛋白 γ干扰素(IFN-γ) 白细胞介素1β(IL-1β)

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三氯杀螨砜对斑马鱼胚胎的生态毒理效应

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作者 刘宝 刘静 +2 位作者 张旭程 杨艳 黎美凤 《南方农业学报》 北大核心 2025年第8期2662-2671,共10页

【目的】探究三氯杀螨砜(TDN)对斑马鱼胚胎的生态毒理效应,为揭示TDN对水生生物的毒性作用机制及有机氯农药的环境生态风险评估提供数据支撑。【方法】将斑马鱼胚胎分别暴露于0、6、9、12、15、18 mg/L的TDN溶液中,记录TDN暴露对斑马鱼... 【目的】探究三氯杀螨砜(TDN)对斑马鱼胚胎的生态毒理效应,为揭示TDN对水生生物的毒性作用机制及有机氯农药的环境生态风险评估提供数据支撑。【方法】将斑马鱼胚胎分别暴露于0、6、9、12、15、18 mg/L的TDN溶液中,记录TDN暴露对斑马鱼胚胎存活率、卵黄囊面积、心率和体长的影响。使用试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量。实时荧光定量PCR检测斑马鱼胚胎凋亡、炎症和免疫相关基因的相对表达量。采用吖啶橙染色和苏丹黑染色鉴定细胞凋亡水平和嗜中性粒细胞数量。【结果】随TDN浓度和暴露时间增加,斑马鱼胚胎存活率逐渐降低,在0~15 mg/L的TDN中暴露72 h,斑马鱼胚胎卵黄囊面积显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)增大,心率显著或者极显著降低,体长缩短,15 mg/L TDN处理斑马鱼胚胎出现明显的心包水肿。与0 mg/L TDN处理相比,在6、9、12和15 mg/L的TDN暴露下,斑马鱼胚胎CAT活性均极显著升高,MDA含量均有所升高,9、12与15 mg/L TDN处理SOD活性均极显著升高。与0 mg/L TDN处理相比,6、9、12和15 mg/L TDN处理斑马鱼胚胎促凋亡相关基因Bax和P53相对表达量均有所升高,抗凋亡相关基因Bcl-2相对表达量整体上有所降低,炎症相关基因IL-6、IL-8、CXCL-C1C、TNF-α、Myd88和P65相对表达量均有所升高,免疫相关基因Ifnγ和Mxa和Mxb相对表达量均有所升高。吖啶橙染色和苏丹黑染色结果显示,与0 mg/L TDN处理相比,其他各TDN处理细胞凋亡水平整体上升高,嗜中性粒细胞减少。【结论】TDN对斑马鱼胚胎的毒性作用表现在生长发育受损、诱导氧化应激反应、细胞凋亡、炎症反应和抑制免疫功能,其可能通过“氧化应激—凋亡—免疫紊乱”途径发挥作用。含氯杀虫剂的危害机理具有共性,应在环境风险评估中重视其对机体稳态的长期干扰。 展开更多

关键词 斑马鱼胚胎 三氯杀螨砜 氧化应激 细胞凋亡 炎症反应

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新型冠状病毒Omicron变异株RBD二聚体蛋白抗体的制备与鉴定

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作者 王婷 陶飞飞 +7 位作者 刘仕国 余文捡 王宇 黎美凤 李名志 刘树荣 王毅豪 孔令保 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期972-982,共11页

【目的】研究旨在构建新冠病毒Omicron变异株(B.1.1.529)RBD重组质粒pET-28a-RBD-dimer,利用E.coli BL21(DE3)原核细胞表达S-RBD二聚体蛋白并制备其多克隆抗体,用于研究Omicron变异株RBD的免疫学功能。【方法】运用Golden Gate无缝克隆... 【目的】研究旨在构建新冠病毒Omicron变异株(B.1.1.529)RBD重组质粒pET-28a-RBD-dimer,利用E.coli BL21(DE3)原核细胞表达S-RBD二聚体蛋白并制备其多克隆抗体,用于研究Omicron变异株RBD的免疫学功能。【方法】运用Golden Gate无缝克隆技术将密码子优化的RBD二聚体基因克隆到pET-28a载体中,构建pET-28a-RBD-dimer重组质粒。经表达条件优化后,以镍离子亲和层析法分离纯化RBD二聚体蛋白。将纯化的蛋白作为免疫原制备鼠源抗RBD二聚体蛋白的多克隆抗体,利用间接ELISA、IFA及Western blotting试验技术分别检测多克隆抗体的效价和特异性。【结果】ELISA试验结果显示该多克隆抗体的效价高达1:256000,IFA及Western blotting试验结果表明该多克隆抗体可特异性识别原核、真核细胞表达的RBD二聚体蛋白以及商业化RBD蛋白,具有较好的特异性、反应原性和灵敏性。【结论】研究成功使用原核细胞表达Omicron RBD二聚体蛋白,其具有较好的免疫原性,可以有效制备具有较高抗体效价、特异性及灵敏度的多克隆抗体,为进一步研究原核表达的RBD二聚体蛋白的生物学功能,Omicron变异株的鉴别诊断和亚单位疫苗的开发提供依据。 展开更多

关键词 Omicron变异株 受体结合域 原核表达 多克隆抗体

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猴痘病毒A23R蛋白的表达、纯化及其小鼠抗血清制备 被引量：2

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作者 王毅豪 李名志 +8 位作者 贾梦乐 杨领弟 熊嘉琪 王婷 王宇 刘树荣 郭韫丽 孔令保 黎美凤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期642-648,共7页

目的大肠杆菌细胞表达和镍柱纯化猴痘病毒(MPXV)A23R蛋白,制备小鼠抗MPXV A23R的高效价抗血清。方法构建重组质粒pET-28a-MPXV-A23R,并转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,优化蛋白表达条件后获得大量蛋白。镍柱纯化重组蛋白A23R并进行Wester... 目的大肠杆菌细胞表达和镍柱纯化猴痘病毒(MPXV)A23R蛋白,制备小鼠抗MPXV A23R的高效价抗血清。方法构建重组质粒pET-28a-MPXV-A23R,并转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,优化蛋白表达条件后获得大量蛋白。镍柱纯化重组蛋白A23R并进行Western blot法鉴定。纯化后的A23R蛋白免疫小鼠,制备A23R多克隆抗体,采用ELISA检测抗体免疫滴度。结果在0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度37℃、诱导20 h时,获得的A23R重组蛋白表达量最大,纯化后的蛋白纯度约为96.07%,经Western blot法鉴定为目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠,第6周时IgG抗体的效价达到1∶102400。结论成功获得高表达和高纯度的重组A23R蛋白,并制备了小鼠抗MPXV-A23R的高效价血清。 展开更多

关键词 猴痘病毒(MPXV) A23R 表达 纯化 免疫

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猴痘病毒E2L蛋白的表达、纯化及免疫原性评价 被引量：2

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作者 贾梦乐 熊嘉琦 +6 位作者 杨领弟 王毅豪 孙静婷 王婷 黎美凤 孔令保 彭棋 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期3056-3063,共8页

【目的】构建猴痘病毒E2L蛋白原核表达载体,经诱导表达及纯化鉴定后免疫接种昆明小鼠评价其免疫原性,为猴痘病毒诊断试剂、疫苗和特异性治疗药物的研发打下基础。【方法】根据GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列优化密码子后合成E2L基因... 【目的】构建猴痘病毒E2L蛋白原核表达载体,经诱导表达及纯化鉴定后免疫接种昆明小鼠评价其免疫原性,为猴痘病毒诊断试剂、疫苗和特异性治疗药物的研发打下基础。【方法】根据GenBank已公布的猴痘病毒基因组序列优化密码子后合成E2L基因,将其克隆至表达载体pET-28a(+)上构建原核表达载体pET-28a-E2L,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)受态细胞,采用控制变量的方法对融合蛋白最佳诱导表达条件进行优化,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。融合蛋白经His-Bind柱亲和层析纯化后,经腹腔注射免疫昆明小鼠,从免疫当天(第0 d)开始每隔7 d通过断尾法采集昆明小鼠血清1次,采用ELISA检测血清抗体效价。【结果】以构建的原核表达载体pET-28a-E2L转化BL21(DE3)受态细胞后,经IPTG诱导,能成功表达获得融合蛋白E2L,且主要以包涵体的形式进行表达。融合蛋白E2L的最佳诱导表达条件为40℃下以1.0 mmol/L IPTG诱导16 h,通过His-Bind柱亲和层析纯化时的最佳咪唑洗脱浓度为100 mmol/L。昆明小鼠免疫试验结果表明,纯化后的融合蛋白E2L能诱导昆明小鼠产生较高水平的体液免疫,至免疫第42 d昆明小鼠血清仍然维持较高抗体水平,抗体效价高达1∶70400,说明融合蛋白E2L具有良好的免疫原性。【结论】猴痘病毒E2L蛋白在原核表达系统能实现高效表达,且以纯化后的融合蛋白E2L免疫昆明小鼠能产生较强的体液免疫,表明具有良好的免疫原性,可用于新型猴痘病毒检测方法及预防疫苗的研发。 展开更多

关键词 猴痘病毒 E2L蛋白 原核表达 免疫原性

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持续感染口蹄疫病毒VP1蛋白对细胞转录组的影响 被引量：1

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作者 杨黎 刘萍 +7 位作者 韦美华 柯雄锋 刘丽清 宋静静 方莹 唐欢 孔令保 辛秀 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期411-421,共11页

【目的】通过转录组测序(RNA-Seq)方法分析持续感染口蹄疫病毒结构蛋白VP1诱导的PK-15细胞基因表达谱的变化,探索VP1蛋白对宿主细胞信号通路的影响。为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。【方法】PK-15... 【目的】通过转录组测序(RNA-Seq)方法分析持续感染口蹄疫病毒结构蛋白VP1诱导的PK-15细胞基因表达谱的变化,探索VP1蛋白对宿主细胞信号通路的影响。为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。【方法】PK-15细胞分别转染pCAGGS-HA(对照载体)、pCAGGS-HA-Pi-VP1质粒,转染36 h后,Western blot检测VP1蛋白表达,同时提取两组细胞总RNA进行转录组测序(每组3个重复,2组6个样本)。将测序所得的序列进行过滤比对,获得差异表达基因后,对差异表达基因进行了生物信息学分析。采用qRT-PCR验证关键差异表达基因的表达。【结果】RNA-Seq共鉴定出3376个差异表达基因(DEGs)|log2(Fold Change)|>0和padj<0.05,其中上调基因1744个,下调基因1632个。许多参与免疫反应和炎症的效应基因差异表达。GO和KEGG富集分析显示,差异基因GO条目绝大部分与核糖体有关,而KEGG富集中涉及了与天然免疫相关的信号通路,如TNF信号通路、Toll受体信号通路。【结论】pCAGGS-HA-Pi-VP1转染PK-15细胞之后,改变了细胞的表达谱,获得的DEGs及其功能注释信息有助于理解其对宿主细胞的影响,为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。 展开更多

关键词 转录组 基因表达谱 FMDV 持续感染 VP1 差异表达基因

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非洲猪瘟病毒LAMP可视化检测方法的建立 被引量：2

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作者 卓泽文 刘树荣 +2 位作者 李名志 王宇 孔令保 《中南农业科技》 2022年第3期21-24,共4页

利用环介导等温扩增技术(LAMP),根据非洲猪瘟病毒(ASFV)ASFV p72基因保守序列设计一组LAMP引物。采用单因素试验,对影响LAMP反应的5个重要因素反应温度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst 3.0 DNA聚合酶浓度进行优化,使用钙黄绿素-... 利用环介导等温扩增技术(LAMP),根据非洲猪瘟病毒(ASFV)ASFV p72基因保守序列设计一组LAMP引物。采用单因素试验,对影响LAMP反应的5个重要因素反应温度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst 3.0 DNA聚合酶浓度进行优化,使用钙黄绿素-MnCl2显色液进行可视化判定,并进行灵敏度和特异性检测。结果表明,优化后的LAMP反应可检测低至103拷贝/μL的ASFV模板,且具有良好的特异性。反应体系中各成分的最佳浓度分别为甜菜碱1.25 mol/L、Mg2+8 mmol/L、dNTPs 1.25 mmol/L、Bst 3.0 DNA聚合酶320 U/mL,最佳反应温度为67℃。试验成功建立了ASFV LAMP可视化检测方法,适合猪场和农户进行ASFV的现场快速检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) 环介导等温扩增(LAMP) 可视化 快速检测

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新冠病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

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作者 刘树荣 陶飞飞 +3 位作者 熊园翔 温林 郭韫丽 孔令保 《生物灾害科学》 2022年第4期415-422,共8页

【目的】为了实现对新冠病毒一步法检测。【方法】采用RT-LAMP技术,利用具有反转录酶活性的Bst3.0 DNA聚合酶,以新冠病毒N蛋白基因为模板设计LAMP引物,成功建立了以新冠N蛋白基因为靶基因的RT-LAMP检测方法。同时对反应条件中的温度、... 【目的】为了实现对新冠病毒一步法检测。【方法】采用RT-LAMP技术,利用具有反转录酶活性的Bst3.0 DNA聚合酶,以新冠病毒N蛋白基因为模板设计LAMP引物,成功建立了以新冠N蛋白基因为靶基因的RT-LAMP检测方法。同时对反应条件中的温度、镁离子浓度、NTP浓度、甜菜碱浓度以及酶浓度进行优化。通过加入钙黄绿素和氯化锰显色剂对反应结果进行判定,用ASFV p54质粒和JEV NS1质粒与稀释后模板做对照。【结果】温度为66℃,镁离子浓度为6mmol/L,甜菜碱浓度为1 mol/L,NTP为1.4 mmol/L,酶浓度为160 U/L为最优反应条件。【结论】证明了Bst3.0 DNA聚合酶对新冠N蛋白基因检测是成功的,该方法具有良好的特异性以及灵敏度。 展开更多

关键词 新型冠状病毒 环介导等温扩增技术 可视化

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