目的肾间质纤维化(renal interstital fibrosia,RIF)的核心是肾小管上皮细胞转分化。探讨促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞(human kidney cells,HK-2)转分化的影响及其可能机制。方法体外培养HK-2细...目的肾间质纤维化(renal interstital fibrosia,RIF)的核心是肾小管上皮细胞转分化。探讨促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞(human kidney cells,HK-2)转分化的影响及其可能机制。方法体外培养HK-2细胞,按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组(高糖终浓度30 mmol/L)、甘露醇对照组(甘露醇浓度24.5mmol/L)、EPO对照组(EPO终浓度为20 U/m L)、5 U/m L EPO干预组、10 U/m L EPO干预组、20 U/m L EPO干预组及ROCK抑制剂(Y27632)组(Y27632终浓度为30μmol/L,加入Y27632 30 min后加高糖,高糖终浓度为30 mmol/L),各组均刺激24 h。应用RT-PCR法检测细胞Rho A mRNA、ROCK1 mRNA的水平;细胞免疫荧光法检测细胞E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(αsmoothmuscleactin,α-SMA)的表达;ELISA法检测上清液纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达。结果 RT-PCR结果显示高糖诱导组Rho A mRNA及ROCK1 mRNA表达较空白对照组显著升高(1.400±0.022 vs 0.945±0.132,1.913±0.011 vs1.007±0.002,P<0.05);5、10、20 U/m L EPO干预组,Rho A mRNA的表达水平(0.278±0.006、0.770±0.005、0.334±0.009)均较空白对照组(0.945±0.131)减少(P<0.05),ROCK1 mRNA的表达水平(1.418±0.006、0.919±0.004、0.477±0.002)较空白对照组(51.007±0.002)减少(P<0.05);ELISA及细胞免疫荧光结果显示高糖诱导组FN、α-SMA蛋白的表达较空白对照组明显增加[(14 545.53±317.27)ng/m L vs(2 582.50±87.20)ng/m L,0.335±0.006 vs 0.224±0.006,P<0.05];直线相关性分析,高糖诱导组,5、10、20 U/m L EPO干预组Rho A mRNA与ROCK1 mRNA表达均呈正相关(P<0.05)。高糖诱导组α-SMA较空白对照组上升,E-钙黏蛋白较空白对照组下降(P<0.05);EPO干预组及ROCK抑制剂组E-钙黏蛋白表达较高糖诱导组增加,而α-SMA表达下降(P<0.05);ELISA结果显示,EPO干预组ROCK抑制剂组FN表达较高糖诱导组下降(P<0.05),且下降程度与EPO浓度相关。结论 EPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化,从而延缓肾间质纤维化,其机制可能与Rho A/ROCK信号通路有关。展开更多
目的探讨重组人促红细胞生成素（r Hu EPO）治疗肾间质纤维化（RIF）的作用机制。方法 2014年7月—2015年6月,将人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）随机分为7组：空白对照组（E1组）：未加任何刺激物;r Hu EPO对照组（E2组）：r Hu EPO终浓度...目的探讨重组人促红细胞生成素（r Hu EPO）治疗肾间质纤维化（RIF）的作用机制。方法 2014年7月—2015年6月,将人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）随机分为7组：空白对照组（E1组）：未加任何刺激物;r Hu EPO对照组（E2组）：r Hu EPO终浓度为20 U/ml;人纯化清蛋白诱导组（E3组）：人纯化清蛋白终浓度为5 mg/ml;E4组：加人纯化清蛋白（5 mg/ml）和r Hu EPO（5 U/ml）;E5组：加人纯化清蛋白（5 mg/ml）和r Hu EPO（10 U/ml）;E6组：加人纯化清蛋白（5 mg/ml）和r Hu EPO（20 U/ml）;Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y27632组（E7组）：加ROCK抑制剂Y27632（10μmol/L）,30 min后加人纯化清蛋白（5 mg/ml）。采用细胞增殖试验检测刺激16、24、48、72 h时各组细胞增殖数,反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测Rho A、ROCK mRNA表达水平,细胞免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测纤维连接蛋白（FN）表达水平。结果 16 h时,各组细胞增殖数比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。24、48、72 h时,各组细胞增殖数比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组高于E1组、E2组,E4-E6组高于E3组,E7组低于E3组,E5组、E6组高于E4组,E6组高于E5组（P〈0.05）。各组Rho A mRNA表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组高于E1组、E2组,E4-E6组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。各组ROCK mRNA表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组高于E1组、E2组,E4-E7组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。各组α-SMA表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E5组高于E1组、E2组,E4-E7组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。各组E-cadherin表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组低于E1组、E2组,E4-E7组高于E3组,E5组、E6组高于E4组,E6组高于E5组（P〈0.05）。各组FN表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E5组高于E1组、E2组,E4-E7组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。E3组、E4组、E5组、E6组Rho A mRNA与ROCK mRNA均呈正相关（P〈0.05）。结论人纯化清蛋白能诱导HK-2细胞发生上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT）,进而发生RIF,而r Hu EPO通过阻断EMT的Rho A/ROCK信号转导通路从而抑制RIF发生,且在一定范围内r Hu EPO水平越高,其抑制作用越强。展开更多
目的临床治疗虽可延缓肾间质纤维化进展,却无法逆转肾功能丧失。探讨重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,r Hu EPO)对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为7组:空...目的临床治疗虽可延缓肾间质纤维化进展,却无法逆转肾功能丧失。探讨重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,r Hu EPO)对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为7组:空白对照组、r Hu EPO对照组(20 U/m L r Hu EPO)、清蛋白刺激组(5 mg/m L清蛋白)、5 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+5 U/m L r Hu EPO)、10 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+10 U/m L r Hu EPO)、20 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+20 U/m L r Hu EPO)、Rho激酶抑制组(10μmol/L Y27632+5 mg/m L清蛋白),各组均作用24 h。观察各组细胞形态的变化;RT-PCR检测各组细胞Rho A、ROCK1 mRNA及白细胞介素-6因子(interleukin-6,IL-6)mRNA含量水平;ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、IL-6蛋白的含量表达。结果空白对照组、r Hu EPO干预组显示鹅卵石或者铺路石样形态,清蛋白刺激组表现出细长梭状改变,呈现纤维细胞样外观。5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组细胞向鹅卵石样复转,Rho激酶抑制组细胞形态呈椭圆形、细胞间隙稍增大;与空白对照组比较,清蛋白刺激组Rho A、ROCK1 mRNA及IL-6 mRNA显著升高(P<0.05),而5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组逐渐下调(P<0.05),且与r Hu EPO浓度负相关;与清蛋白刺激组比较,Rho激酶抑制组ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA表达下调(P<0.05),但Rho A mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA结果显示:清蛋白刺激组上清液TNF-α、IL-6蛋白[(1 347.54±41.52)ng/L、(884.62±0.73)pg/L]表达较空白对照组[(452.32±33.23)ng/L,(95.12±0.32)pg/L]显著增高(P<0.05),5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组、Rho激酶抑制组TNF-α表达[(1 003.32±3.42)、(821.32±21.32)、(590.15±7.68)、(488.13±65.03)ng/L)]较清蛋白刺激组[(1 347.54±41.52)ng/L]下降(P<0.05)、IL-6蛋白表达[(656.68±0.55)、(422.35±0.22)、(217.32±0.35)、(309.49±0.21)pg/L]亦较清蛋白刺激组[(884.62±0.73)pg/L]下降(P<0.05),5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 r Hu EPO可能通过减少炎症因子的产生来抑制清蛋白诱导的HK-2细胞转分化过程,其作用机制部分涉及Rho A/ROCK信号通路。展开更多
文摘目的肾间质纤维化(renal interstital fibrosia,RIF)的核心是肾小管上皮细胞转分化。探讨促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞(human kidney cells,HK-2)转分化的影响及其可能机制。方法体外培养HK-2细胞,按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组(高糖终浓度30 mmol/L)、甘露醇对照组(甘露醇浓度24.5mmol/L)、EPO对照组(EPO终浓度为20 U/m L)、5 U/m L EPO干预组、10 U/m L EPO干预组、20 U/m L EPO干预组及ROCK抑制剂(Y27632)组(Y27632终浓度为30μmol/L,加入Y27632 30 min后加高糖,高糖终浓度为30 mmol/L),各组均刺激24 h。应用RT-PCR法检测细胞Rho A mRNA、ROCK1 mRNA的水平;细胞免疫荧光法检测细胞E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(αsmoothmuscleactin,α-SMA)的表达;ELISA法检测上清液纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达。结果 RT-PCR结果显示高糖诱导组Rho A mRNA及ROCK1 mRNA表达较空白对照组显著升高(1.400±0.022 vs 0.945±0.132,1.913±0.011 vs1.007±0.002,P<0.05);5、10、20 U/m L EPO干预组,Rho A mRNA的表达水平(0.278±0.006、0.770±0.005、0.334±0.009)均较空白对照组(0.945±0.131)减少(P<0.05),ROCK1 mRNA的表达水平(1.418±0.006、0.919±0.004、0.477±0.002)较空白对照组(51.007±0.002)减少(P<0.05);ELISA及细胞免疫荧光结果显示高糖诱导组FN、α-SMA蛋白的表达较空白对照组明显增加[(14 545.53±317.27)ng/m L vs(2 582.50±87.20)ng/m L,0.335±0.006 vs 0.224±0.006,P<0.05];直线相关性分析,高糖诱导组,5、10、20 U/m L EPO干预组Rho A mRNA与ROCK1 mRNA表达均呈正相关(P<0.05)。高糖诱导组α-SMA较空白对照组上升,E-钙黏蛋白较空白对照组下降(P<0.05);EPO干预组及ROCK抑制剂组E-钙黏蛋白表达较高糖诱导组增加,而α-SMA表达下降(P<0.05);ELISA结果显示,EPO干预组ROCK抑制剂组FN表达较高糖诱导组下降(P<0.05),且下降程度与EPO浓度相关。结论 EPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化,从而延缓肾间质纤维化,其机制可能与Rho A/ROCK信号通路有关。
文摘目的探讨重组人促红细胞生成素（r Hu EPO）治疗肾间质纤维化（RIF）的作用机制。方法 2014年7月—2015年6月,将人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）随机分为7组：空白对照组（E1组）：未加任何刺激物;r Hu EPO对照组（E2组）：r Hu EPO终浓度为20 U/ml;人纯化清蛋白诱导组（E3组）：人纯化清蛋白终浓度为5 mg/ml;E4组：加人纯化清蛋白（5 mg/ml）和r Hu EPO（5 U/ml）;E5组：加人纯化清蛋白（5 mg/ml）和r Hu EPO（10 U/ml）;E6组：加人纯化清蛋白（5 mg/ml）和r Hu EPO（20 U/ml）;Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y27632组（E7组）：加ROCK抑制剂Y27632（10μmol/L）,30 min后加人纯化清蛋白（5 mg/ml）。采用细胞增殖试验检测刺激16、24、48、72 h时各组细胞增殖数,反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测Rho A、ROCK mRNA表达水平,细胞免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达水平,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测纤维连接蛋白（FN）表达水平。结果 16 h时,各组细胞增殖数比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。24、48、72 h时,各组细胞增殖数比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组高于E1组、E2组,E4-E6组高于E3组,E7组低于E3组,E5组、E6组高于E4组,E6组高于E5组（P〈0.05）。各组Rho A mRNA表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组高于E1组、E2组,E4-E6组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。各组ROCK mRNA表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组高于E1组、E2组,E4-E7组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。各组α-SMA表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E5组高于E1组、E2组,E4-E7组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。各组E-cadherin表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E6组低于E1组、E2组,E4-E7组高于E3组,E5组、E6组高于E4组,E6组高于E5组（P〈0.05）。各组FN表达水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;其中E3-E5组高于E1组、E2组,E4-E7组低于E3组,E5组、E6组低于E4组,E6组低于E5组（P〈0.05）。E3组、E4组、E5组、E6组Rho A mRNA与ROCK mRNA均呈正相关（P〈0.05）。结论人纯化清蛋白能诱导HK-2细胞发生上皮细胞-间充质细胞转分化（EMT）,进而发生RIF,而r Hu EPO通过阻断EMT的Rho A/ROCK信号转导通路从而抑制RIF发生,且在一定范围内r Hu EPO水平越高,其抑制作用越强。
文摘目的临床治疗虽可延缓肾间质纤维化进展,却无法逆转肾功能丧失。探讨重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,r Hu EPO)对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为7组:空白对照组、r Hu EPO对照组(20 U/m L r Hu EPO)、清蛋白刺激组(5 mg/m L清蛋白)、5 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+5 U/m L r Hu EPO)、10 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+10 U/m L r Hu EPO)、20 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+20 U/m L r Hu EPO)、Rho激酶抑制组(10μmol/L Y27632+5 mg/m L清蛋白),各组均作用24 h。观察各组细胞形态的变化;RT-PCR检测各组细胞Rho A、ROCK1 mRNA及白细胞介素-6因子(interleukin-6,IL-6)mRNA含量水平;ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、IL-6蛋白的含量表达。结果空白对照组、r Hu EPO干预组显示鹅卵石或者铺路石样形态,清蛋白刺激组表现出细长梭状改变,呈现纤维细胞样外观。5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组细胞向鹅卵石样复转,Rho激酶抑制组细胞形态呈椭圆形、细胞间隙稍增大;与空白对照组比较,清蛋白刺激组Rho A、ROCK1 mRNA及IL-6 mRNA显著升高(P<0.05),而5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组逐渐下调(P<0.05),且与r Hu EPO浓度负相关;与清蛋白刺激组比较,Rho激酶抑制组ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA表达下调(P<0.05),但Rho A mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA结果显示:清蛋白刺激组上清液TNF-α、IL-6蛋白[(1 347.54±41.52)ng/L、(884.62±0.73)pg/L]表达较空白对照组[(452.32±33.23)ng/L,(95.12±0.32)pg/L]显著增高(P<0.05),5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组、Rho激酶抑制组TNF-α表达[(1 003.32±3.42)、(821.32±21.32)、(590.15±7.68)、(488.13±65.03)ng/L)]较清蛋白刺激组[(1 347.54±41.52)ng/L]下降(P<0.05)、IL-6蛋白表达[(656.68±0.55)、(422.35±0.22)、(217.32±0.35)、(309.49±0.21)pg/L]亦较清蛋白刺激组[(884.62±0.73)pg/L]下降(P<0.05),5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 r Hu EPO可能通过减少炎症因子的产生来抑制清蛋白诱导的HK-2细胞转分化过程,其作用机制部分涉及Rho A/ROCK信号通路。
