目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TATRBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验。方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Moti...目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TATRBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验。方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Motif1)与细胞穿膜多肽TAT融合构建3TAT-RBD,并通过原核表达体系进行目的蛋白的表达和纯化。获取重组3TATRBD蛋白后,利用非变性胶电泳检测3TAT-RBD与荧光标示Cy3-dsRNA的结合能力。利用蛋白导入法和荧光显微镜观察3TAT-RBD将Cy3-dsRNA导入胶质瘤细胞的效率。在细胞水平检测和比较3TAT-RBD和Lipofectimine 2000将Cy3-dsRNA导入细胞的效率以及对沉默线粒体分裂蛋白动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)的效果。结果:通过原核表达体系获得3TAT-RBD重组蛋白,体外结合实验证实3TAT-RBD与双链dsRNA具有良好的结合能力。荧光显微镜观察也发现3TAT-RBD与Lipofectimine 2000均能将Cy3-dsRNA导入gli36胶质细胞。在RNA干扰实验中发现,3TAT-RBD和Lipofectimine2000均能有效地抑制Drp1的表达,Lipo+siRNA和3TAT-RBD+siRNA组Drp1的表达水平分别为对照组的36%和42%。结论:本研究中构建的3TAT-RBD利用了细胞穿膜多肽和RBD与dsRNA结合特性,有效地将siRNA导入细胞进行基因沉默实验,这将为今后RNA干扰实验提供新的工具。展开更多
文摘目的:表达和纯化3转录反式激活因子-RNA结合结构域(3 Trans-Activator of Transcription-RNA binding domain,3TATRBD)重组蛋白,并利用蛋白导入法将siRNA运输到细胞中进行基因沉默实验。方法:将双链RNA激活蛋白激酶PKR的RNA结合域(Motif1)与细胞穿膜多肽TAT融合构建3TAT-RBD,并通过原核表达体系进行目的蛋白的表达和纯化。获取重组3TATRBD蛋白后,利用非变性胶电泳检测3TAT-RBD与荧光标示Cy3-dsRNA的结合能力。利用蛋白导入法和荧光显微镜观察3TAT-RBD将Cy3-dsRNA导入胶质瘤细胞的效率。在细胞水平检测和比较3TAT-RBD和Lipofectimine 2000将Cy3-dsRNA导入细胞的效率以及对沉默线粒体分裂蛋白动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)的效果。结果:通过原核表达体系获得3TAT-RBD重组蛋白,体外结合实验证实3TAT-RBD与双链dsRNA具有良好的结合能力。荧光显微镜观察也发现3TAT-RBD与Lipofectimine 2000均能将Cy3-dsRNA导入gli36胶质细胞。在RNA干扰实验中发现,3TAT-RBD和Lipofectimine2000均能有效地抑制Drp1的表达,Lipo+siRNA和3TAT-RBD+siRNA组Drp1的表达水平分别为对照组的36%和42%。结论:本研究中构建的3TAT-RBD利用了细胞穿膜多肽和RBD与dsRNA结合特性,有效地将siRNA导入细胞进行基因沉默实验,这将为今后RNA干扰实验提供新的工具。
