小鼠肝脏细胞质膜蛋白质组的提取和二维液相色谱分离

1

作者 李红梅 陈丽 +3 位作者 夏高晓 赵明哲 胡水旺 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1947-1949,1953,共4页

目的提取小鼠肝脏细胞质膜蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离细胞质膜蛋白质组的方法。方法采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心分离和富集分小鼠肝脏细胞质膜蛋白,样品经脱盐及用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH8.... 目的提取小鼠肝脏细胞质膜蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离细胞质膜蛋白质组的方法。方法采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心分离和富集分小鼠肝脏细胞质膜蛋白,样品经脱盐及用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH8.5～4.0之间的组分进行二维反相高效液相色谱分离,最后将获得的二维UV图通过ProteoVue软件转换成UV/pI图谱。结果成功提取了肝脏细胞质膜蛋白,并通过二维液相色谱成功建立了小鼠肝脏细胞质膜蛋白的二维UV/pI图谱,收集了一维色谱聚焦分离的pH8.5～4.0区间的16个组分,并将每个组分分进行二维色谱分离后转换为UV/pI图谱。结论为进一步全面研究小鼠肝脏细胞质膜蛋白功能和疾病差异蛋白质组研究打下了基础。 展开更多

关键词 细胞质膜蛋白质 二维液相色谱 蛋白质组 肝脏

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人高迁移率族蛋白1的原核细胞表达及其功能研究 被引量：5

2

作者 赵雷 刘靖华 +4 位作者 唐靖 李志杰 刘亚伟 邓鹏 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1119-1123,共5页

目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序... 目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-HMGB1融合蛋白,用Ni-NTA亲和树脂纯化。将纯化得到的HMGB1蛋白经透析和过滤除菌后,刺激人脐静脉内皮细胞,24h后收集培养上清,经LiquiChip液相蛋白芯片系统检测细胞因子。结果:构建的pET14b/HMGB1表达质粒经酶切和测序验证正确;表达的目的蛋白经Western blotting验证能被His抗体识别;检查了纯化的HMGB1蛋白对HUVEC产生细胞因子的影响,发现重组的HMGB1可诱导白细胞介素8(IL-8)上调,并且呈剂量依赖性关系。结论:成功构建了His-HMGB1原核细胞表达质粒并纯化得到重组的HMGB1;在HUVEC模型上证实所得到的HMGB1蛋白具有生物学活性。本实验为进一步研究HMGB1的功能提供了重要的实验材料。 展开更多

关键词 高迁移率族蛋白质类 原核表达 细胞因子类 脐静脉内皮细胞

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重组人CRP的表达纯化及其内化进入HeLa细胞的观察 被引量：2

3

作者 陈腾祥 李红梅 +4 位作者 胡水旺 赵明哲 刘亚伟 刘靖华 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期1155-1160,共6页

目的:构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体,表达纯化his-EGFP-CRP蛋白,观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞。方法:利用特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上;对阳性克隆进行PCR... 目的:构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体,表达纯化his-EGFP-CRP蛋白,观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞。方法:利用特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化,梯度透析复性,并与HeLa细胞孵育,利用荧光显微镜观察其内化入胞。结果:PCR、双酶切和测序鉴定表明,pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒构建正确;转化实验发现,该质粒在BL21(DE3)中能够被大量诱导表达;蛋白纯化及荧光显微镜观察结果表明,复性后的表达产物可结合于HeLa细胞膜,孵育一定时间后,可定位于胞质及胞核。结论:成功地构建了带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人CRP原核表达载体,该载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达重组蛋白his-EGFP-CRP,纯化复性后的重组人CRP能与HeLa肿瘤细胞结合,并能内化入胞,移位入核。 展开更多

关键词 C反应蛋白 载体构建 基因表达 蛋白质复性 HELA细胞

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人CAT启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定 被引量：2

4

作者 姚琦 黄劭 +2 位作者 刘亚伟 刘靖华 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期2149-2151,共3页

目的构建人过氧化氢酶(CAT)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为进一步研究CAT表达调控奠定基础。方法以人类基因组DNA为模板,PCR获得-404～+16大小的启动子片段,将其定向插入pDsRed1-1载体,构建pDsRed-CATp红色荧光蛋白报告基因... 目的构建人过氧化氢酶(CAT)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为进一步研究CAT表达调控奠定基础。方法以人类基因组DNA为模板,PCR获得-404～+16大小的启动子片段,将其定向插入pDsRed1-1载体,构建pDsRed-CATp红色荧光蛋白报告基因载体。瞬时转染NIH/3T3细胞,观察CAT启动子对H2O2刺激的反应。结果pDsRed-CATp经双酶切及DNA测序分析鉴定准确无误;该载体瞬时转染NIH/3T3细胞,静息状态呈现弱转录,H2O2刺激后,转录水平明显增强。结论成功构建CAT启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,对H2O2刺激反应良好,为研究CAT基因表达调控提供了有效的工具。 展开更多

关键词 过氧化氢酶 红色荧光蛋白 调节基因 报告基因

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两种细胞系中内源性C-反应蛋白的表达和定位分析

5

作者 陈腾祥 李红梅 +4 位作者 胡水旺 杨婷 刘亚伟 刘靖华 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期675-678,共4页

目的观察在不同刺激条件下,不同组织来源细胞系中内源性C-反应蛋白(CRP)的表达及定位情况。方法培养人单核细胞系THP-1和人肝细胞系LO2,用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞;使用内毒素(LPS)对两种细胞进行刺激,同时收集LPS刺激后... 目的观察在不同刺激条件下,不同组织来源细胞系中内源性C-反应蛋白(CRP)的表达及定位情况。方法培养人单核细胞系THP-1和人肝细胞系LO2,用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞;使用内毒素(LPS)对两种细胞进行刺激,同时收集LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清加入到LO2细胞的培养液中进行孵育,运用Western blot和免疫细胞化学技术检测上述刺激条件下CRP在两种细胞中的表达及其定位情况。结果Western blot检测表明,在未受到刺激时,两种细胞的裂解物中均检测到一定量的CRP,在细胞培养液上清中没有检测到;受到LPS刺激后,THP-1细胞内的CRP表达增加,且在培养液上清中也检测到少量的CRP,但对于LO2细胞,刺激前后CRP的表达和分泌没有明显变化;当用LPS刺激后的THP-1细胞的培养液上清处理LO2细胞后,在LO2的细胞裂解物和培养液上清中均检测到CRP。免疫细胞化学检测结果显示,整个THP-1细胞中均可检测到标记的CRP的荧光信号,其中以核内的最明显,LPS刺激可以增加该蛋白的表达,使其核定位更加明显;在LO2细胞中,CRP定位于核外,LPS刺激对其表达和定位没有明显影响,而给予LPS刺激的THP-1细胞培养液上清处理后,LO2细胞中标记CRP的荧光信号增强,尤其以细胞膜上的增强明显。结论LPS不能直接上调肝细胞LO2内的CRP表达,却可以诱导THP-1表达分泌某些细胞因子来增加CRP的合成分泌;CRP在肝细胞系LO2和单核-巨噬细胞系THP-1中的定位有明显不同,在LO2中主要表现为分泌型蛋白的定位特征,而在THP-1细胞中却有明显的核定位表现。 展开更多

关键词 C-反应蛋白 蛋白表达 蛋白定位 单核细胞 肝细胞 佛波酯 内毒素

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α_1-抗胰蛋白酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

6

作者 刘承武 胡水旺 +3 位作者 陈登宇 冯国开 邓鹏 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期408-411,共4页

目的构建鼠α1-抗胰蛋白酶(AAT)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达及定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到AAT编码序列。然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH... 目的构建鼠α1-抗胰蛋白酶(AAT)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达及定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到AAT编码序列。然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明构建正确。转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建带HA标签的AAT真核表达载体。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为下一步深入研究AAT在细胞内的相关生物学功能提供了一个重要工具。 展开更多

关键词 Α1-抗胰蛋白酶 血凝素 细胞内定位 载体构建

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脓毒症单核巨噬细胞特异性结合肽的筛选 被引量：6

7

作者 丁宁 刘承武 +3 位作者 李志杰 刘靖华 邓鹏 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1045-1050,共6页

利用噬菌体随机肽库展示技术,筛选出与脓毒症单核/巨噬细胞特异性结合的短肽,探索脓毒症治疗的新方法.分别以经过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的人外周血单核细胞株(THP-1)细胞作为筛选的靶细胞,以未经LPS处理的THP-1细胞作为非... 利用噬菌体随机肽库展示技术,筛选出与脓毒症单核/巨噬细胞特异性结合的短肽,探索脓毒症治疗的新方法.分别以经过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的人外周血单核细胞株(THP-1)细胞作为筛选的靶细胞,以未经LPS处理的THP-1细胞作为非特异性噬菌体吸附细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮"差减"筛选,经过细胞ELISA验证阳性噬菌体克隆,对获得的阳性克隆进行DNA测序及生物信息学分析,并进一步利用免疫荧光实验,鉴定噬菌体克隆与LPS处理THP-1细胞的结合特异性.4轮筛选后,随机挑取的噬菌体克隆,测序后得到可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合肽.对去冗余后的七肽进行Clustal W多序列比对分析和BlastP蛋白同源相似性分析,细胞免疫荧光检测确定获得的噬菌体展示七肽可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合.噬菌体随机肽库技术为脓毒症单核/巨噬细胞表面靶位的筛选提供了高效、快捷的筛选体系,实验获得的多肽基序具有高度保守性和细胞特异性,这些多肽的生物活性将是下一步的研究内容. 展开更多

关键词 单核 巨噬细胞 脂多糖 噬菌体展示 肽库 脓毒症

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p38MAPK基因敲除对亚砷酸盐诱导细胞凋亡的影响 被引量：5

8

作者 刘爱华 龚小卫 +5 位作者 魏洁 明小燕 王达安 邓鹏 罗深秋 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期892-895,共4页

目的:研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在应激刺激诱导的细胞凋亡中的作用。方法:p38+/+和p38-/-细胞用NaAsO2刺激后,用多聚甲醛固定及DAPI染核,利用荧光显微镜观察细胞核的形态改变。NaAsO2刺激的p38+/+和p38-/-细胞用Annexin V-FITC... 目的:研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在应激刺激诱导的细胞凋亡中的作用。方法:p38+/+和p38-/-细胞用NaAsO2刺激后,用多聚甲醛固定及DAPI染核,利用荧光显微镜观察细胞核的形态改变。NaAsO2刺激的p38+/+和p38-/-细胞用Annexin V-FITC与PI双标后,用流式细胞分析仪分析细胞凋亡百分率。结果:NaAsO2刺激后,大部分p38-/-细胞产生典型的凋亡细胞形态学变化,p38+/+细胞仅少数细胞出现核固缩。而且,p38-/-细胞中凋亡细胞百分率较刺激前和p38+/+细胞都显著增加,而p38+/+细胞的凋亡率没有明显变化。结论:p38基因敲除使细胞对亚砷酸盐应激刺激的耐受性下降,容易发生凋亡;p38丝裂原活化蛋白激酶可能在提高细胞的应激适应能力上发挥着重要的作用。 展开更多

关键词 p38 MAP激酶 基因敲除 细胞凋亡 应激 亚砷酸盐类

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维拉帕米预处理对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究 被引量：8

9

作者 丁宁 王芳 +1 位作者 肖慧 王迪芬 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期1061-1064,共4页

目的观察不同时间点予维拉帕米预处理对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及寻找维拉帕米最佳预处理时间点。方法沙土鼠33只,随机分为正常对照A组(n=6)、缺血损伤B组(n=6)、维拉帕米预处理C～E组(n=7),即脑缺血前48、24、12h分别予2.5%... 目的观察不同时间点予维拉帕米预处理对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及寻找维拉帕米最佳预处理时间点。方法沙土鼠33只,随机分为正常对照A组(n=6)、缺血损伤B组(n=6)、维拉帕米预处理C～E组(n=7),即脑缺血前48、24、12h分别予2.5%维拉帕米(2mg/kg·b.w.)腹腔注射。观察指标为超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及丙二醛(MDA)、内皮素(ET)、降钙素基因相关肽(CGRP)的含量。每组随机取一大小约1mm×1mm左颞前叶脑组织,电镜观察脑组织超微结构的改变。结果维拉帕米预处理各组的GSH活性显著高于缺血损伤组(P<0.01),ET的含量显著低于缺血损伤组(P<0.05)。C、D组SOD活性显著高于B组(P<0.05),E组SOD活性高于B组,但无统计学意义;C、D组MDA含量显著低于B组(P<0.05),E组MDA含量低于B组,但无统计学意义。C、D、E各组CGRP的含量高于B组,但无统计学意义。维拉帕米预处理各组的脑组织超微结构损伤改变不大或仅有轻微的改变,而缺血组脑组织超微结构表现出严重的损伤。结论缺血前48～12h予维拉帕米预处理对沙土鼠的脑缺血再灌注损伤有不同程度的保护作用,以预先给药48h组的效果较为显著,这种作用与其增加体内抗氧化物质SOD、GSH的活性及拮抗ET的毒性有关。 展开更多

关键词 脑缺血再灌注 维拉帕米 预处理 脑保护

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NF-κB介导MRP8/14诱导的人肺泡上皮A549细胞凋亡 被引量：4

10

作者 黄林 杨晨 +3 位作者 梁婕 罗海华 姜勇 刘爱华 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期701-706,共6页

目的:探讨髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对人肺泡上皮A549细胞存活及凋亡的影响,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14以不同剂量或刺激时间处理A549细胞,CCK-8法检测其对细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western b... 目的:探讨髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对人肺泡上皮A549细胞存活及凋亡的影响,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14以不同剂量或刺激时间处理A549细胞,CCK-8法检测其对细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法及间接免疫荧光法检测A549细胞内NF-κB p65蛋白核移位情况;Western blot法检测NF-κB p65蛋白磷酸化水平;使用NF-κB特异性抑制剂Bay 11-7082探讨NF-κB在凋亡过程中的作用。结果:MRP8/14能以剂量和时间依赖的方式影响A549细胞的存活(P<0.05),流式细胞技术检测结果表明MRP8/14处理后A549细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。此外,MRP8/14能够诱导NF-κB p65蛋白发生显著磷酸化,并移位至细胞核中,NF-κB信号通路明显激活,而NF-κB特异性抑制剂Bay 11-7082能够明显抑制MRP8/14诱导的细胞凋亡(P<0.01)。结论:NF-κB在MRP8/14所导致的肺泡上皮细胞凋亡过程发挥了重要作用。 展开更多

关键词 急性肺损伤 细胞凋亡 髓样相关蛋白8/14 肺泡Ⅱ型上皮细胞 核因子ΚB

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咯利普兰通过NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7细胞中促炎性因子的释放 被引量：3

11

作者 杨晨 王俊 +3 位作者 黄林 罗海华 姜勇 刘爱华 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期1098-1103,共6页

目的:探讨PDE4抑制剂咯利普兰抑制髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中促炎性因子释放的刺激作用,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14刺激RAW264.7细胞,采用液相芯片技术和实时荧光定量PCR(q PCR)技... 目的:探讨PDE4抑制剂咯利普兰抑制髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中促炎性因子释放的刺激作用,并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法:MRP8/14刺激RAW264.7细胞,采用液相芯片技术和实时荧光定量PCR(q PCR)技术分别检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的蛋白和mRNA水平;咯利普兰预处理RAW264.7细胞后,MRP8/14刺激细胞,采用液相芯片技术和q PCR技术分别检测TNF-α和IL-6的蛋白水平和mRNA水平;Western blot法检测NF-κB P65蛋白磷酸化水平;间接免疫荧光法检测RAW264.7细胞内NF-κB P65蛋白核移位情况。结果:液相芯片及q PCR结果显示MRP8/14具有很强的促炎性因子TNF-α和IL-6释放的作用(P<0.01),而咯利普兰可以显著减弱MRP8/14促炎性因子释放的作用(P<0.05)。此外,MRP8/14能够诱导NF-κB P65蛋白发生磷酸化,胞核中P65蛋白增加;而咯利普兰显著减弱NF-κB P65蛋白磷酸化(P<0.05)。结论:咯利普兰可能通过NF-κB途径显著减弱MRP8/14的促炎作用。 展开更多

关键词 急性肺损伤 咯利普兰 髓样相关蛋白8/14 炎性因子 核因子ΚB

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细菌脂多糖识别系统 被引量：13

12

作者 丁宁 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期711-717,共7页

细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可激活单核/巨噬细胞、内皮细胞合成和释放多种细胞因子,导致全身性炎症反应.LPS识别及跨膜信号转导是引起细胞效应的关键.在过去的几年中,有关LPS结合蛋白家族和受体系统及其作用机制的研究突飞猛进... 细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可激活单核/巨噬细胞、内皮细胞合成和释放多种细胞因子,导致全身性炎症反应.LPS识别及跨膜信号转导是引起细胞效应的关键.在过去的几年中,有关LPS结合蛋白家族和受体系统及其作用机制的研究突飞猛进,大量研究表明LPS识别涉及复杂的蛋白质间相互作用.在此对LPS识别系统成员及其功能的最新研究进展进行综述,并详细介绍新近提出的"LPS受体激活簇"理论. 展开更多

关键词 脂多糖 脂多糖受体 脓毒症 蛋白质-蛋白质相互作用

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晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达 被引量：3

13

作者 李煜生 龚小卫 +2 位作者 程蔚蔚 魏洁 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期983-986,共4页

目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体。方法采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。以RAGE/pcDNA3重组质粒... 目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体。方法采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列。利用Western blotting在HEK293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测。结果RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK293细胞中表达。结论成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具。 展开更多

关键词 RAGE 载体构建 基因表达

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p38 MAPK对PDGF诱导的细胞迁移的调控作用 被引量：2

14

作者 龚小卫 魏洁 +3 位作者 李煜生 程蔚蔚 邓鹏 姜勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期205-207,共3页

目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的细胞迁移中的作用。方法PDGF刺激小鼠NI H3T3细胞后,利用免疫印迹法检测p38磷酸化程度的改变情况。利用Transwell细胞迁移系统来观察PDGF对NI H3T3细胞迁移的诱导... 目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的细胞迁移中的作用。方法PDGF刺激小鼠NI H3T3细胞后,利用免疫印迹法检测p38磷酸化程度的改变情况。利用Transwell细胞迁移系统来观察PDGF对NI H3T3细胞迁移的诱导作用,以及p38基因敲除对PDGF诱导的细胞迁移的影响。结果PDGF能显著诱导NI H3T3细胞迁移(P<0.001),且在此过程中p38能被磷酸化激活,p38基因敲除能阻断PDGF诱导的细胞迁移(P<0.001)。结论p38MAPK参与了PDGF诱导的细胞迁移的调控。 展开更多

关键词 P38 MAP激酶 血小板源生长因子 细胞运动

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人p53不同突变体的构建、表达及其对亚砷酸盐诱导细胞凋亡的影响 被引量：1

15

作者 刘爱华 龚小卫 +5 位作者 魏洁 明小燕 王达安 邓鹏 罗深秋 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期671-674,共4页

目的构建人p53的不同突变体,并在真核细胞中表达,研究这些突变体对应激刺激诱导细胞凋亡的影响。方法采用PCR方法扩增人p53 cDNA序列,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3/HA载体中,对阳性克隆进行酶切和PCR鉴定。将阳性重组体的第1... 目的构建人p53的不同突变体,并在真核细胞中表达,研究这些突变体对应激刺激诱导细胞凋亡的影响。方法采用PCR方法扩增人p53 cDNA序列,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3/HA载体中,对阳性克隆进行酶切和PCR鉴定。将阳性重组体的第15位和第46位丝氨酸突变为丙氨酸,并转染NIH3T3细胞,观察其在NIH3T3细胞内的表达情况。转染不同突变体的NIH3T3细胞用Annexin V-FITC和碘化丙啶双标后,利用流式细胞术检测亚砷酸盐刺激前后的凋亡情况。结果构建的pcDNA3/HA-p53(WT)、pcDNA3/HA-p53(S15A)和pcDNA3/HA-p53(S46A)是正确的,且能在NIH3T3细胞内有效表达。流式细胞术检测表明,p53(WT)的表达使亚砷酸盐诱导的细胞凋亡增加,p53(S15A)的表达使细胞凋亡减少,而p53(S46A)没有明显影响。结论p53的第15位丝氨酸在其介导亚砷酸盐诱导的细胞凋亡中具有重要作用。 展开更多

关键词 P53 定点突变 载体构建 基因表达 细胞凋亡 亚砷酸盐

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p38L12-TAT融合肽对山梨糖醇引起的ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用 被引量：1

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作者 郭爱华 刘志锋 +7 位作者 李海玉 唐靖 李志杰 刘亚伟 龚小卫 刘靖华 邓鹏 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期402-408,共7页

构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET1... 构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET14bHisTATEGFP),经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒转化原核表达菌,诱导表达纯化融合蛋白;将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析,检测融合蛋白的细胞内转导活性;通过检测内源性ATF2磷酸化水平,鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体,并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTEp38L12和HTEp38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率,并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV1TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化,从而发挥对p38激活特异性抑制的功能. 展开更多

关键词 Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白 丝裂原活化蛋白 LOOP 12 细胞转导系统

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p53基因敲除对细胞迁移的影响 被引量：1

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作者 龚小卫 魏洁 +4 位作者 李煜生 程蔚蔚 王旭 邓鹏 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期1132-1135,共4页

目的研究p53基因敲除对细胞迁移的影响。方法观察p53+/+和p53-/-细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响。结果在血清诱导下,p53+/+细胞能形成板状伪足和进行迁移,... 目的研究p53基因敲除对细胞迁移的影响。方法观察p53+/+和p53-/-细胞中血清诱导的板状伪足形成情况,以及利用Transwell细胞迁移系统观察p53基因敲除对血清诱导的细胞迁移的影响。结果在血清诱导下,p53+/+细胞能形成板状伪足和进行迁移,而p53-/-细胞中板状伪足的形成和细胞迁移都被阻断。结论p53在血清诱导的细胞迁移中具有重要作用。 展开更多

关键词 P53 基因敲除 细胞迁移

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细胞穿透肽在肿瘤治疗中的应用 被引量：1

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作者 黄劭 刘亚伟 姜勇 《生理科学进展》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期301-306,共6页

随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的... 随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的入胞转运方式如电穿孔、脂质体转染等均存在对细胞的额外毒副作用,且作用范围局限于体外实验。细胞穿透肽是一类以非受体依赖方式,非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽。它们可以与多种生物活性物质连接并携带其进入细胞,这一特性为它们成为理想的药物载体提供了可能。本文对使用细胞穿透肽作为载体转运具有抗癌作用的生物大分子进入细胞的抗癌实验予以介绍。 展开更多

关键词 肿瘤 细胞穿透多肽 跨膜转运

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pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

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作者 王达安 龚小卫 +7 位作者 刘爱华 梅柱中 王丹 明小燕 王旭 魏洁 邓鹏 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期2310-2313,共4页

目的构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质... 目的构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质体PolyFect介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAPtag-MK2融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAPtag-MK2的表达及细胞内定位情况。结果重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAPtag-MK2主要分布在核内。结论成功构建pNTAP-MK2真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对MK2定位产生明显影响。 展开更多

关键词 MAPK激活蛋白激酶2 pNTAP 真核表达载体 分子克隆 基因表达

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晚期糖基化终末产物受体不同突变体真核表达载体的构建和表达

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作者 程蔚蔚 李煜生 +4 位作者 龚小卫 赵琳琳 王继刚 邓鹏 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1779-1781,1785,共4页

目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)不同突变体的真核细胞表达载体。方法采用定点突变技术将亚克隆在载体pcDNA3-HA上的野生型RAGE构建成不同突变体pcDNA3-HA-RAGE(S391A)、pcDNA3-HA-RAGE(S399A)、pcDNA3-HA-RAGE(S400A)... 目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)不同突变体的真核细胞表达载体。方法采用定点突变技术将亚克隆在载体pcDNA3-HA上的野生型RAGE构建成不同突变体pcDNA3-HA-RAGE(S391A)、pcDNA3-HA-RAGE(S399A)、pcDNA3-HA-RAGE(S400A)、pcDNA3-HA-RAGE(T401A),经测序鉴定正确后转染HEK293细胞,利用Westernblotting检测各突变体的表达。结果RAGE不同突变体经测序鉴定正确无误后,在HEK293细胞中得到高量表达。结论成功构建了RAGE不同突变体的真核表达载体,并在真核细胞中进行了表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 晚期糖基化终末产物受体 定点突变 载体构建 基因表达

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