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一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建
被引量：
8
1
作者
郭爱华
刘志锋
+3 位作者
孙学刚
李海玉
邓鹏
姜勇
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第5期545-548,共4页
目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、...
目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。
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关键词
HIV-1反式激活因子
蛋白质转导结构域
融合蛋白
细胞内转导
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职称材料
基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究
被引量：
3
2
作者
杨丽萍
刘志锋
+2 位作者
黎永明
李志杰
姜勇
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第5期553-557,共5页
目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高...
目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高渗刺激下,通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平,以观察由TAT转导进入细胞His-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明,载体构建正确;SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白;Westernblot表明,融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞;导入His-TAT-p38蛋白后,结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能,而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能,从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化,使得信号不能传递下去,进而抑制p38MAPK通路的活动。结论成功建立了基于TAT的蛋白转运系统,并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞;进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性,在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平,而后者则显著抑制p38信号通路的活性。
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关键词
Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白
P38丝裂原活化蛋白激酶
蛋白转导
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职称材料
Rac1-GTPase慢病毒的构建及生物学活性鉴定
被引量：
1
3
作者
王斌
李娟
+2 位作者
张磊
张琳
张璐
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第2期197-201,共5页
目的构建携带绿色荧光蛋白的Rac1-GTPase显性负效突变体(Rac1N17)和组成型活性突变体(Rac1L61)的慢病毒。方法构建Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒,并以酶切和测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统包装制备Rac1-GTPase突变体...
目的构建携带绿色荧光蛋白的Rac1-GTPase显性负效突变体(Rac1N17)和组成型活性突变体(Rac1L61)的慢病毒。方法构建Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒,并以酶切和测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统包装制备Rac1-GTPase突变体慢病毒上清,用其感染大鼠前皮质神经元,分别进行Rac1生物学活性检测、细胞转染效率鉴定与神经元形态学观察。结果构建的Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒经酶切与测序鉴定正确,包装的慢病毒滴度为1×106TU/ml。用制备的慢病毒上清感染原代培养的前皮质神经元,Rac1生物学活性检测结果显示Rac1N17慢病毒显著抑制表皮生长因子诱导的Rac1活性的升高,而Rac1L61慢病毒感染神经元Rac1活性显著升高。感染效率鉴定显示病毒上清可感染80%以上的前皮质神经元。形态学观察显示经慢病毒感染后的神经元其胞体与树突分支清晰可见。结论成功制备了Rac1N17和Rac1L61慢病毒,并成功实现了慢病毒感染前皮质神经元,为进一步研究Rho蛋白家族信号通路提供了一个重要工具。
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关键词
Rac1-GTPase
慢病毒
绿色荧光蛋白
生物学活性
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职称材料
题名
一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建
被引量：
8
1
作者
郭爱华
刘志锋
孙学刚
李海玉
邓鹏
姜勇
机构
南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室
出处
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第5期545-548,共4页
基金
国家高技术研究发展(863)计划课题(2001AA234061)
广东省科技计划项目(A1090202)
+1 种基金
广东省自然科学基金重点项目(NO.13058)
广州市科技计划项目(2001-Z-035-01-1)~~
文摘
目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。
关键词
HIV-1反式激活因子
蛋白质转导结构域
融合蛋白
细胞内转导
Keywords
human immunodeficiency virus type-1 trans-activator
protein transduction domain
recombinant protein
intracellular transduction
分类号
R341 [医药卫生—基础医学]
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职称材料
题名
基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究
被引量：
3
2
作者
杨丽萍
刘志锋
黎永明
李志杰
姜勇
机构
南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室
出处
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第5期553-557,共5页
基金
广东省科技计划项目(A1090202)
广州市科技计划项目(2001-z-035-01-1)
广东省自然科学基金重点项目(13058)~~
文摘
目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高渗刺激下,通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平,以观察由TAT转导进入细胞His-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明,载体构建正确;SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白;Westernblot表明,融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞;导入His-TAT-p38蛋白后,结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能,而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能,从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化,使得信号不能传递下去,进而抑制p38MAPK通路的活动。结论成功建立了基于TAT的蛋白转运系统,并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞;进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性,在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平,而后者则显著抑制p38信号通路的活性。
关键词
Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白
P38丝裂原活化蛋白激酶
蛋白转导
Keywords
human immunodeficiency virus type-1
p38 mitogen-activated protein kinase
protein transduction
分类号
R341 [医药卫生—基础医学]
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职称材料
题名
Rac1-GTPase慢病毒的构建及生物学活性鉴定
被引量：
1
3
作者
王斌
李娟
张磊
张琳
张璐
机构
南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室
南方医科大学
组
织
学
与胚胎
学
教研室
出处
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第2期197-201,共5页
基金
国家自然科学基金(30770821)
广东省自然科学基金重点项目(92510515000008)
+1 种基金
广州市科技计划项目(2007Z3-E0551)
广东省科技计划项目(2005B50301010)
文摘
目的构建携带绿色荧光蛋白的Rac1-GTPase显性负效突变体(Rac1N17)和组成型活性突变体(Rac1L61)的慢病毒。方法构建Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒,并以酶切和测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统包装制备Rac1-GTPase突变体慢病毒上清,用其感染大鼠前皮质神经元,分别进行Rac1生物学活性检测、细胞转染效率鉴定与神经元形态学观察。结果构建的Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒经酶切与测序鉴定正确,包装的慢病毒滴度为1×106TU/ml。用制备的慢病毒上清感染原代培养的前皮质神经元,Rac1生物学活性检测结果显示Rac1N17慢病毒显著抑制表皮生长因子诱导的Rac1活性的升高,而Rac1L61慢病毒感染神经元Rac1活性显著升高。感染效率鉴定显示病毒上清可感染80%以上的前皮质神经元。形态学观察显示经慢病毒感染后的神经元其胞体与树突分支清晰可见。结论成功制备了Rac1N17和Rac1L61慢病毒,并成功实现了慢病毒感染前皮质神经元,为进一步研究Rho蛋白家族信号通路提供了一个重要工具。
关键词
Rac1-GTPase
慢病毒
绿色荧光蛋白
生物学活性
Keywords
Rac1-GTPase
lentivirus
green fluorescent protein
biological activity
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建
郭爱华
刘志锋
孙学刚
李海玉
邓鹏
姜勇
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006
8
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职称材料
2
基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究
杨丽萍
刘志锋
黎永明
李志杰
姜勇
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2006
3
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下载PDF
职称材料
3
Rac1-GTPase慢病毒的构建及生物学活性鉴定
王斌
李娟
张磊
张琳
张璐
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010
1
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职称材料
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