SA-hTNF-α膜锚定修饰治疗表浅膀胱癌的实验研究 被引量：3

1

作者 陈忠 谭万龙 +3 位作者 黄鑫 梁中锟 徐翠香 高基民 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期936-940,共5页

目的探讨一种新型蛋白质锚定技术与人肿瘤坏死因子α(hTNF-α)相结合在小鼠表浅膀胱癌治疗中的作用。方法将120只雌性C57BL/6j小鼠分为5组:正常未处理组(空白对照组)、PBS对照组、可溶hTNF-α治疗组、SA-GFP锚定组、SA-hTNF-α锚定治疗... 目的探讨一种新型蛋白质锚定技术与人肿瘤坏死因子α(hTNF-α)相结合在小鼠表浅膀胱癌治疗中的作用。方法将120只雌性C57BL/6j小鼠分为5组:正常未处理组(空白对照组)、PBS对照组、可溶hTNF-α治疗组、SA-GFP锚定组、SA-hTNF-α锚定治疗组,每组22只小鼠。建立小鼠正位表浅膀胱癌模型,24h后,将小鼠膀胱内膜生物素化,继而将hTNF-α融合蛋白灌注入小鼠膀胱中。每4d重复膀胱灌注锚定治疗1次,共6次。免疫组化检测SA-hTNF-α融合蛋白在生物素化的小鼠膀胱黏膜的存留时间及膀胱黏膜和肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的分布,观察肿瘤生长情况及小鼠的生存期。检测肿瘤特异性淋巴细胞的杀伤活性。用MB49细胞再次攻击对SA-hTNF-α融合蛋白治疗有效的小鼠,观察肿瘤生长情况及小鼠的存活期。结果免疫组化显示:SA-hTNF-α融合蛋白可以在膀胱黏膜表面上稳定存留7d;MB49肿瘤细胞膀胱内种植后第60天,SA-hTNF-α锚定治疗组有18只小鼠存活(18/22),其中9只小鼠体外无触及肿瘤;PBS组全部死亡。对9只无瘤存活的小鼠再次用MB49细胞皮下攻击,60d后5只小鼠仍存活(5/9),与对照组有显著性差异(P<0.05)。膀胱癌病灶中CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞,SA-hTNF-α锚定治疗组较PBS对照组明显增多(P<0.05)。SA-hTNF-α锚定治疗组小鼠的杀伤效应明显强于正常组小鼠(P<0.05)。结论 SA-hTNF-α稳定的原位锚定于小鼠膀胱黏膜表面,可有效抑制小鼠表浅膀胱癌进展,显著延长荷瘤小鼠的生存时间,有效抵抗同源肿瘤细胞的再次攻击。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子Α 链亲和素 生物免疫治疗 膀胱癌

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SA/hIL21双功能融合蛋白的表达、纯化及生物学活性检测 被引量：3

2

作者 法萍萍 张振 +2 位作者 李金龙 胡志明 高基民 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期1240-1243,1249,共5页

目的制备链亲和素(SA)标记的人白细胞介素21融合蛋白(SA-hIL-21),检测其生物学活性。方法构建hIL21-SA-pET21及pET24a-SA-hIL21质粒,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达两种双功能融合蛋白,并利用镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)纯化,之后透析复性,Wes... 目的制备链亲和素(SA)标记的人白细胞介素21融合蛋白(SA-hIL-21),检测其生物学活性。方法构建hIL21-SA-pET21及pET24a-SA-hIL21质粒,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达两种双功能融合蛋白,并利用镍金属螯合层析柱(Ni-NTA)纯化,之后透析复性,Western blotting进行鉴定,最后利用MTT法检测hIL21-SA及SA-hIL21融合蛋白与抗CD3单克隆抗体(anti-CD3)共刺激人外周血淋巴细胞的增殖活性,流式细胞仪分析两种融合蛋白对生物素化的MB49肿瘤细胞的锚定修饰效率。结果 hIL21-SA及SA-hIL21重组融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体蛋白的30%,经复性后hIL21-SA及SA-hIL21具有了双重活性,即不仅可以与抗CD3单抗共刺激淋巴细胞的增殖,而且具有了SA介导的高效结合已生物素化的MB49肿瘤细胞表面的功能(表面修饰效率95.18%,96.91%)。结论本实验成功研制了具有双重活性的hIL21-SA及SA-hIL21融合蛋白,两种融合蛋白的双功能活性无显著性差异,该项研究为SA/hIL21双功能融合蛋白应用于肿瘤疫苗以及肿瘤局部治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 白细胞介素21 链亲和素 融合蛋白 锚定

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SA/mIL15双功能融合蛋白的制备及其生物学鉴定 被引量：1

3

作者 陈艳丽 许晓玲 +4 位作者 唐佳 聂小霞 宋志纯 胡志明 高基民 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期107-110,共4页

目的:制备链亲和素(SA)标记的鼠白细胞介素-15融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,并研究其生物学功能。方法:构建pET24a-SA-L-mIL15和pET21a-mIL15-L-SA重组表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,对所表达的蛋白分别采用镍金... 目的:制备链亲和素(SA)标记的鼠白细胞介素-15融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,并研究其生物学功能。方法:构建pET24a-SA-L-mIL15和pET21a-mIL15-L-SA重组表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,对所表达的蛋白分别采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析和阴离子交换(DEAE)层析进行纯化,透析复性。MTT法检测融合蛋白对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)分析融合蛋白对生物素化的小鼠前列腺癌(RM-1)细胞表面锚定修饰效率。结果:SA-mIL15和mIL15-SA在大肠杆菌中实现了高效表达,约占细菌总蛋白的20%。制备的SA-mIL15和mIL15-SA融合蛋白纯度达到95%,并具有双重活性,即:mIL15促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞的增殖活性和SA介导的高效结合至表面已生物素化的RM-1细胞的功能(表面锚定修饰效率均大于95%)。其中,SA-mIL15双功能融合蛋白促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞增殖活性为1×106IU/mg,mIL15-SA活性为2×105IU/mg。结论:SA/mIL15双功能融合蛋白具有双重活性,为mIL15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 白细胞介素15 链亲和素 融合蛋白 锚定

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SA-TNF-α融合蛋白高效表达、纯化及复性研究 被引量：10

4

作者 徐翠香 胡志明 +1 位作者 李金龙 高基民 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期412-415,共4页

目的研究链亲和素标记的人肿瘤坏死因子α(SA-TNF-α)融合蛋白的纯化、复性方法,并研究其生物学功能。方法在大肠杆菌中表达SA-TNF-α融合蛋白,对表达的SA-TNF-α融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,分别在尿素体系和盐酸胍... 目的研究链亲和素标记的人肿瘤坏死因子α(SA-TNF-α)融合蛋白的纯化、复性方法,并研究其生物学功能。方法在大肠杆菌中表达SA-TNF-α融合蛋白,对表达的SA-TNF-α融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,分别在尿素体系和盐酸胍体系中复性,Western blot对其进行鉴定。MTT法检测SA-TNF-α融合蛋白对L929细胞的杀伤活性,流式细胞仪分析SA-TNF-α融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰率。结果SA-TNF-α融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,表达的目标蛋白占菌体蛋白30%以上,镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱纯化的SA-TNF-α融合蛋白纯度达到95.7%,经过两种体系复性形成的SA-TNF-α融合蛋白的二聚体和多聚体均具有双功能活性:既对L929细胞有杀伤活性又能锚定修饰生物素化的MB49细胞,锚定修饰率大于90%。结论初步建立了SA-TNF-α融合蛋白制备工艺,SA-TNF-α二聚体和多聚体均具有双功能活性,SA-TNF-α融合蛋白的研制有望为肿瘤的治疗提供新的治疗方法及新型药物。 展开更多

关键词 人肿瘤坏死因子Α 链亲和素 融合蛋白 蛋白纯化 蛋白复性

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1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究 被引量：2

5

作者 汤明芳 陆晓和 +3 位作者 高基民 钟彦彦 罗微 周明乾 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期739-741,745,共4页

目的评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性。方法rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生... 目的评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性。方法rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率。MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响。结果转染后2d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90%(MOI=5×103),58.56%(MOI=5×104),68.31%(MOI=5×105)。AAV1-EGFP转染ECV304细胞后,细胞生长及形态正常,MTT法显示转染后72、96h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异。结论rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体。 展开更多

关键词 腺相关病毒 绿色荧光蛋白基因 脐静脉内皮细胞 转染

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去甲斑蝥素对肿瘤细胞DNA复制起始蛋白Cdc6的抑制作用 被引量：15

6

作者 李金龙 蔡于琛 +1 位作者 胡志明 高基民 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1851-1853,共3页

目的本研究旨在明确去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)对肿瘤细胞DNA复制起始蛋白Cdc6的抑制作用。方法采用MTT法检测NCTD对多种肿瘤细胞,包括:HeLa、HepG2、Jurkat以及Ramos细胞增殖的抑制作用;采用Westernblotting检测NCTD对细胞Cdc6... 目的本研究旨在明确去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)对肿瘤细胞DNA复制起始蛋白Cdc6的抑制作用。方法采用MTT法检测NCTD对多种肿瘤细胞,包括:HeLa、HepG2、Jurkat以及Ramos细胞增殖的抑制作用;采用Westernblotting检测NCTD对细胞Cdc6蛋白表达的影响;BrdU掺入实验检测NCTD对肿瘤细胞DNA复制的影响。结果 NCTD显著抑制上述4种肿瘤细胞的增殖,肿瘤细胞Cdc6蛋白被降解,DNA复制受到明显抑制。结论 NCTD可诱导多种肿瘤细胞Cdc6蛋白的降解并有效抑制肿瘤细胞的DNA复制及增殖,Cdc6蛋白可能是NCTD的一个有效抗肿瘤靶点。 展开更多

关键词 去甲斑蝥素 CDC6 DNA复制

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幽门杆菌Catalase/GST融合蛋白的表达、标签切除及鉴定 被引量：6

7

作者 姜茵 奚月 李妍 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期102-106,共5页

旨在利用GST融合基因表达系统表达幽门螺杆菌Catalase融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签。将重组质粒Catalase/pGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,用IPTG进行诱导表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,Catalase/GST融合... 旨在利用GST融合基因表达系统表达幽门螺杆菌Catalase融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签。将重组质粒Catalase/pGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,用IPTG进行诱导表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,Catalase/GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达在上清中。采用谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B对其进行纯化,得到Catalase/GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western blotting鉴定。高效表达出Catalase/GST融合蛋白的相对分子质量约85 kD,凝血酶成功地切除了GST标签,Western blotting证实Catalase蛋白能被鼠抗Catalase单克隆抗体识别。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 CATALASE 融合表达 GST标签切除 纯化

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CD80-链亲和素融合蛋白锚定的鼻咽癌CNE2细胞增强T细胞的杀伤活性 被引量：1

8

作者 李金龙 常红 +1 位作者 胡志明 高基民 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期398-402,共5页

目的:制备CD80-链亲和素(streptavidin,SA)融合蛋白,研究CD80-SA锚定的鼻咽癌CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。方法:pET21a-CD80-SA-6His质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导CD80-SA融合蛋白的表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后透析复性。流... 目的:制备CD80-链亲和素(streptavidin,SA)融合蛋白,研究CD80-SA锚定的鼻咽癌CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。方法:pET21a-CD80-SA-6His质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导CD80-SA融合蛋白的表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后透析复性。流式细胞仪检测CD80-SA融合蛋白在CNE2细胞表面的锚定效率;LDH释放法检测CD80-SA锚定的CNE2细胞对T细胞杀伤活性的影响。结果:成功制备和纯化了CD80-SA融合蛋白。CNE2细胞表面低表达CD80分子[(2.2±0.18)%]。CD80-SA融合蛋白可有效地锚定于生物素化的CEN2细胞表面,锚定效率可达73%。CD80-SA锚定的CNE2细胞可有效激活T细胞的杀伤作用,效靶比在1∶1、1∶20、1∶40时T细胞的杀伤率分别约为(37±3.12)%、(51±2.63)%和(58±2.47)%,均显著高于对照CNE2细胞激活的T细胞(均P<0.01)。结论:CD80-SA融合蛋白可有效锚定于生物素化的CNE2细胞表面,从而增强T细胞对CNE2细胞的杀伤活性。 展开更多

关键词 CD80 链亲和素 生物素 融合蛋白 鼻咽癌细胞 T细胞 杀伤

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链亲和素标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子融合蛋白的制备(英文) 被引量：3

9

作者 白莉 胡志明 +5 位作者 王菲 许晓玲 夏昶 金丽琴 李金龙 高基民 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1389-1393,共5页

目的制备链亲和素(SA)标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA,并鉴定其生物学活性。方法构建原核表达质粒PET24a-6His-SA-L-hGM-CSF和PET24a-hGM-CSF-L-SA-6His,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用镍... 目的制备链亲和素(SA)标记的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA,并鉴定其生物学活性。方法构建原核表达质粒PET24a-6His-SA-L-hGM-CSF和PET24a-hGM-CSF-L-SA-6His,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性。复性后蛋白用DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析进一步纯化。MTT法检测融合蛋白对人红白血病细胞(TF-1)的增殖活性。流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰效率。结果 SA-hGM-CSF和hGM-CSF-SA两种融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,目标蛋白占菌体蛋白的20%以上,纯化后纯度达到96%以上。两种融合蛋白均具有双功能活性,即同时具有hGM-CSF的促进人红白血病细胞增殖的活性和SA介导的高效结合至表面生物素化的MB49细胞的功能(锚定修饰率大于99%)。结论研制的SA/hGM-CSF融合蛋白具有双重活性,可为研制hGM-CSF表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。 展开更多

关键词 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 链亲和素 肿瘤细胞疫苗 融合蛋白

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去甲斑蝥素抑制紫杉醇诱导的UMUC-3人膀胱癌细胞有丝分裂滑脱 被引量：2

10

作者 何悦 颜道宇 +2 位作者 尤昕冉 郑典鹏 李金龙 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期300-306,共7页

目的:探究有丝分裂滑脱在UMUC-3细胞紫杉醇(PTX)耐药中的作用,以及去甲斑蝥素(NCTD)对有丝分裂滑脱的抑制作用.方法:以UMUC-3膀胱癌细胞为研究对象,通过Giemsa染色、流式细胞术观察UMUC-3细胞有丝分裂相;台盼蓝染色测定细胞活力;Western... 目的:探究有丝分裂滑脱在UMUC-3细胞紫杉醇(PTX)耐药中的作用,以及去甲斑蝥素(NCTD)对有丝分裂滑脱的抑制作用.方法:以UMUC-3膀胱癌细胞为研究对象,通过Giemsa染色、流式细胞术观察UMUC-3细胞有丝分裂相;台盼蓝染色测定细胞活力;Western bloting检测Cdc6、p-Cdk1蛋白表达水平变化;通过TCGA数据库,分析Cdc6表达与膀胱癌病人生存及预后关系.结果:PTX作用后出现多倍体细胞,G2/M期比例呈现先上升后下降趋势,表明细胞出现有丝分裂滑脱.滑脱呈时间依赖性增加;第4天滑脱细胞数超过50%,且细胞活力开始升高.PTX处理第3天加入NCTD,可有效地阻止多倍体细胞的出现,阻滞细胞于G2/M期,并逆转PTX耐药.机制研究发现,滑脱细胞中Cdc6蛋白表达明显上调,Cdk1活性受到抑制;NCTD可下调Cdc6,维持Cdk1活性.TCGA数据分析显示,Cdc6在膀胱癌中高表达,并提示预后不良.结论:Cdc6通过促进有丝分裂滑脱可介导PTX耐药,NCTD可以通过降解Cdc6逆转PTX耐药. 展开更多

关键词 去甲斑蝥素 紫杉醇 有丝分裂滑脱 CDC6

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用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备

11

作者 郭芳芳 邹立林 +4 位作者 吴英松 胡志明 李金龙 吕建新 高基民 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期955-959,共5页

目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA)/CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准... 目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA)/CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板,扩增CFP10基因,将其克隆到pET24b、pET24b-SA、pET21a-SA三种载体中,转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达,表达产物经镍离子亲和层析(Ni-NTA)柱纯化,透析法复性。三种重组蛋白用双抗体夹心法TRFIA从灵敏度、稳定性两方面进行评价。结果成功构建了pET24b-CFP10、pET24b-SA-CFP10和pET21a-CFP10-SA三种表达载体,重组蛋白CFP10主要为可溶形式表达,融合蛋白CFP10-SA、SA-CFP10均以包涵体形式存在,Ni-NTA柱纯化后透析复性,纯度均可达90%以上。三种重组蛋白经双抗体夹心TRFIA,CFP10-SA灵敏度最高(0.02μg/L),稳定性最好。结论得到了灵敏度高、稳定性好的TRFIA检测CFP10的参照品CFP10-SA融合蛋白,为研制该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒,并应用于临床打下了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 培养滤液蛋白10 时间分辨荧光分析法

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