ppk1基因缺失对脑膜炎大肠杆菌K1株生物学功能的影响 被引量：1

1

作者 彭亮 潘嘉韵 +3 位作者 罗苏 杨正慧 黄慕芳 曹虹 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期965-968,共4页

目的比较大肠杆菌K1株E44敲除ppk1基因后与野生株之间差异并探讨ppk1基因在E.coli K1株致脑膜炎机制中的作用。方法(1)将野生株与敲除株置于56℃2、4、6 min,以比较二者对热刺激的抵抗力差异;(2)利用电子显微镜直接观察以及采用经典的... 目的比较大肠杆菌K1株E44敲除ppk1基因后与野生株之间差异并探讨ppk1基因在E.coli K1株致脑膜炎机制中的作用。方法(1)将野生株与敲除株置于56℃2、4、6 min,以比较二者对热刺激的抵抗力差异;(2)利用电子显微镜直接观察以及采用经典的粘附、侵袭率定量实验比较二者对脑微血管内皮细胞(HBMEC)的粘附和侵袭能力;(3)将细菌与脑微血管内皮细胞共同孵育后,利用激光共聚焦观察二者诱导脑微血管内皮细胞的细胞骨架重排现象。结果与野生株E44相比,ppk1敲除株对于56℃热刺激的抵抗力明显下降;电子显微镜可以观察到,敲除株粘附和侵袭入HBMEC的数量均少于野生株,定量粘附、侵袭实验也进一步证实;借助激光共聚焦发现敲除株诱导HBMEC细胞骨架重排的能力要弱于野生株。结论 ppk1对于脑膜炎大肠杆菌K1株抵抗热刺激、粘附和侵袭HBMEC以及诱导HBMEC的细胞骨架重排具有重要作用。 展开更多

关键词 脑膜炎 聚磷酸盐激酶1 大肠杆菌K1株 基因敲除

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MUC2基因表达对益生菌调节肠屏障作用的影响 被引量：12

2

作者 余晶仪 郝小燕 +6 位作者 龙敏 王勤 屈娅荣 温扬明 张文炳 罗军 曹虹 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期197-201,共5页

目的观察益生菌诱导的乳鼠结肠MUC2基因的表达及其对益生菌抑制E.coli K1株E44黏附侵袭肠屏障作用的影响。方法 SD乳鼠分别用益生菌、E44株和益生菌+E44株三组灌胃7 d后,RT-PCR法观察益生菌和E44株诱导结肠MUC2基因的表达;靶向MUC2基因... 目的观察益生菌诱导的乳鼠结肠MUC2基因的表达及其对益生菌抑制E.coli K1株E44黏附侵袭肠屏障作用的影响。方法 SD乳鼠分别用益生菌、E44株和益生菌+E44株三组灌胃7 d后,RT-PCR法观察益生菌和E44株诱导结肠MUC2基因的表达;靶向MUC2基因的shRNA真核质粒表达载体(shRNA MUC2)和阴性对照shRNA NC转染人结肠癌Lovo细胞,荧光定量PCR法检测其表达水平,并通过竞争性排斥方法检测MUC2基因对益生菌拮抗致病菌E44粘附侵袭的影响。结果灌胃益生菌组SD乳鼠肠道MUC2基因明显上调,而E44组则显著降低。用shRNA MUC2转染Lovo细胞后,与阴性对照组和空白对照组相比,其表达水平明显降低,干扰率为66.7%;益生菌对E44株粘附侵袭抑制作用明显低于未处理组,与对照组相比,E44相对粘附率为56.64%,相对侵袭率为66.64%。结论益生菌诱导的MUC2基因表达上调可能成为拮抗致病菌易位的保护机制之一;MUC2基因沉默后,益生菌对E44粘附侵袭肠上皮细胞的抑制作用明显降低。 展开更多

关键词 MUC2 SHRNA 益生菌 E.COLI K1(E44) 粘附与侵袭

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家蝇幼虫淋巴液的抑菌作用及其SDS-PAGE分析 被引量：7

3

作者 郑学礼 廖奕佶 +3 位作者 胡佳林 温文星 张文炳 徐燕 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期406-409,共4页

目的观察针刺诱导家蝇幼虫血淋巴抗菌物质抑菌作用与抗菌分子。方法室内饲养的家蝇三龄幼虫,经针刺体壁处理后48h,提取其血淋巴,观察单独使用血淋巴和血淋巴与氨苄青霉素混合对9种应试细菌的抑菌效果,血淋巴与抗真菌药氟康唑混合对酵母... 目的观察针刺诱导家蝇幼虫血淋巴抗菌物质抑菌作用与抗菌分子。方法室内饲养的家蝇三龄幼虫,经针刺体壁处理后48h,提取其血淋巴,观察单独使用血淋巴和血淋巴与氨苄青霉素混合对9种应试细菌的抑菌效果,血淋巴与抗真菌药氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果,应用SDS-PAGE分析血淋巴抗菌分子表达。结果针刺家蝇幼虫后48h的血淋巴,作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、黄色小球菌,结果显示:针刺家蝇幼虫后48h的血淋巴对试验9个标准株细菌,均产生明显抑菌环,经单因素方差分析,显示各抑菌试验组的抑菌效果,皆有显著差异(P<0.001)。其中对黄色小球菌抑菌活力最强。1μ1氨苄青酶素与7μ1针刺诱导家蝇幼虫淋巴液混合对白色葡萄球菌抑菌效果呈现最好的加强抑菌作用。针刺诱导家蝇幼虫血淋巴与抗真菌药物氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果呈现明显协同增强作用。SDS-PAGE分析结果显示:针刺幼虫后发育的成蝇和针刺幼虫血淋巴的电泳条带与未针刺者相比,针刺幼虫后发育的成蝇,在24000￣97000范围内表达尤为增强,在12000附近有一条特异性条带。针刺家蝇3龄幼虫血淋巴SDS-PAGE分析显示,在24000、35000、40000￣96000范围内表达明显增强,其中35000、12000条带较为特异。结论本研究进一步验证了家蝇血淋巴的抑菌活性,发现针刺诱导家蝇幼虫血淋巴对黄色小球菌抑菌活力最强,氨苄青霉素与家蝇幼虫淋巴液混合对白色葡萄球菌抑菌效果呈现最好的加强抑菌作用,针刺诱导家蝇幼虫血淋巴与抗真菌药物氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果呈现明显增强作用,上述发现在国内外报道较少,本研究结果,为进一步开发这类抗菌物质,提供了实验资料。 展开更多

关键词 家蝇幼虫 血淋巴 抑菌作用 抗菌物质 SDS-PAGE

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肠道病毒71型感染人脑微血管内皮细胞的初步研究 被引量：6

4

作者 罗文英 赵卫 +4 位作者 彭亮 余晶仪 张立科 张文炳 曹虹 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期240-245,共6页

目的 初步探讨肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）穿血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的相关机制.方法 用人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,HBMECs）建立体外BBB模型,采用EV71毒株感染HBMECs,并... 目的 初步探讨肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）穿血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的相关机制.方法 用人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,HBMECs）建立体外BBB模型,采用EV71毒株感染HBMECs,并设置阴性对照.通过形态学观察、免疫荧光、透射电镜及实时荧光定量PCR方法探讨EV71能否感染HBMECs,激光共聚焦方法观察EV71能否诱导HBMECs微丝骨架的重排.结果 EV71感染后能诱导HBMECs的细胞病变,细胞内可见EV71抗原红色荧光表达及直径为20～30 nm的EV71颗粒存在,实时荧光定量PCR方法证实EV71能在HBMECs内复制,不同时间水平差异有统计学意义（P＜0.01）.细胞感染EV71后失去正常形态,变得极不规则,胞内微丝排列紊乱,极性消失,微丝聚集在细胞边缘.结论 本研究首次证明EV71可以感染HBMECs并复制,并且可以诱导部分HBMECs的骨架重排. 展开更多

关键词 肠道病毒71型 血脑屏障 人脑微血管内皮细胞 细胞骨架

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噬菌体对人肠道正常菌群生态平衡及耐药性的影响 被引量：6

5

作者 赖志豪 谢玉龙 +2 位作者 马超 冯晓颖 曹虹 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期295-300,共6页

肠道微生态是指寄生在宿主肠道内的微生物总称。随着人类微生物计划的开展,肠道微生态代表着人体内最复杂和种群数量最多的共生微生物生态系统,作为一个"微生物器官"被广泛研究。早期对肠道微生态的研究多集中在肠道细菌群落... 肠道微生态是指寄生在宿主肠道内的微生物总称。随着人类微生物计划的开展,肠道微生态代表着人体内最复杂和种群数量最多的共生微生物生态系统,作为一个"微生物器官"被广泛研究。早期对肠道微生态的研究多集中在肠道细菌群落的结构和动态变化,往往忽略了噬菌体的存在。但是近年来因为抗生素的滥用,噬菌体在肠道中的作用日益得到重视。本文拟对肠道细菌、噬菌体、抗生素三者间的关系进行综述,阐述肠道微生物间协同进化的机理,为治疗肠道相关的疾病提供新思路。 展开更多

关键词 肠道微生态 肠道细菌 噬菌体 抗生素

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抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：7

6

作者 李妍 宁云山 +5 位作者 洪燕华 刘宜楚 罗军 龙敏 董文其 李明 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期425-427,共3页

目的制备抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)全菌的单克隆抗体并对其特异性进行初步鉴定。方法用培养的幽门螺杆菌超声破菌后的上清和沉淀为抗原分别免疫BALB／c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体并测定抗体免疫球蛋白亚类、效价及... 目的制备抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)全菌的单克隆抗体并对其特异性进行初步鉴定。方法用培养的幽门螺杆菌超声破菌后的上清和沉淀为抗原分别免疫BALB／c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体并测定抗体免疫球蛋白亚类、效价及亲和力,用重组表达的Hp Lpp20、HspA、urease A、CagA、urease B、catalase蛋白鉴定抗体。结果共获得34株抗Hp的单克隆抗体,其中抗上清31株和抗沉淀3株,34株抗体中针对Lpp20、HspA、urease A、CagA、urease B、catalase蛋白的抗体分别为3、2、4、1、5、2株,目前已鉴定的部分单克隆抗体的亚类均为IgGl,细胞培养上清的效价为1:16-1:32,腹水效价为1:32000～1:64000,抗体亲和常数介于1×10-10mol／L-5．2×10-12mol／L。结论获得特异性针对幽门螺杆菌的单克隆抗体,为幽门螺杆菌的诊断和疫苗研究奠定基础。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 单克隆抗体 疫苗 杂交瘤技术

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肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究 被引量：4

7

作者 彭丽娟 周勇 +3 位作者 杨瑜 惠长野 赵卫 万成松 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期707-710,共4页

目的获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用。方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重... 目的获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用。方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性。结果获得了大小约2805bp的eae片段;构建了重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面。结论高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础。 展开更多

关键词 肠出血性大肠杆菌 0157:H7 EAE 紧密黏附素 基因克隆 重组表达 免疫印记 免疫荧光

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TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌 被引量：3

8

作者 赵素慧 王春晖 +6 位作者 周莹 韦耀 韩桂圆 钮红岺 赵卫 张其威 万成松 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期602-606,共5页

目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制... 目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。 展开更多

关键词 土拉弗朗西斯菌 TAQMAN探针 fopA基因 荧光定量PCR

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外周血中血脑屏障损伤新型标记物脑微血管内皮细胞检测方法的建立 被引量：3

9

作者 李妍 杜蕾 +5 位作者 袁霖 陈德喜 邱嘉文 何肖龙 曹虹 黄胜和 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1733-1737,共5页

目的建立检测人血脑屏障(BBB)损伤新型标记物外周循环血中脑微血管内皮细胞(c BMECs)的实验方法。方法选取33名AIDS脑病病例与13名健康对照分组实验,应用免疫磁珠吸附AIDS脑病病例组及健康对照组外周血中内皮细胞后涂片,免疫荧光三重染... 目的建立检测人血脑屏障(BBB)损伤新型标记物外周循环血中脑微血管内皮细胞(c BMECs)的实验方法。方法选取33名AIDS脑病病例与13名健康对照分组实验,应用免疫磁珠吸附AIDS脑病病例组及健康对照组外周血中内皮细胞后涂片,免疫荧光三重染色法检测涂片中的c BMECs及相关内皮细胞(c ECs和EPCs),并观察其与BBB损伤的关系。结果免疫荧光三重染色法成功检测到细胞型为CD146+/CD133-/S100B+的c BMECs细胞,CD146+/CD133-/S100B-的c ECs细胞和CD133+/CD146+/S100B-的EPCs细胞。结果显示,病例组三种细胞含量均高于对照组,差别有统计学意义(c BMECs、c ECs、EPCs分别为t=4.298,P<0.01;t=4.886,P<0.01;t=4.889,P<0.01)。此外,以c BMECs含量与HIV病毒载量做散点图,可见c BMECs含量随病毒载量增加而增加,且具有统计学意义(r=0.928,P<0.01)。结论用临床病人标本成功建立了在外周血中检测BBB损伤新型标记物c BMECs的实验方法。BBB损伤病人外周血中c BMECs含量显著高于健康人。新型标记物c BMECs在无创检测BBB损伤方面具有重要临床价值。 展开更多

关键词 外周血 生物标记物 脑微血管内皮细胞 血脑屏障损伤

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细胞黏附分子在单核细胞迁移中的作用 被引量：4

10

作者 赖志豪 谢玉龙 +1 位作者 马超 曹虹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1571-1575,1579,共6页

众多疾病尤其是慢性炎症及感染性疾病中,外周血白细胞在内皮细胞的迁移是疾病进展的一个关键步骤。该过程中,单核细胞发挥先天性和适应性的免疫、免疫监视、抗原清除、宿主防御以及炎症清除的多重功能已经得到广泛的重视。单核细胞迁移... 众多疾病尤其是慢性炎症及感染性疾病中,外周血白细胞在内皮细胞的迁移是疾病进展的一个关键步骤。该过程中,单核细胞发挥先天性和适应性的免疫、免疫监视、抗原清除、宿主防御以及炎症清除的多重功能已经得到广泛的重视。单核细胞迁移则作为发挥其功能的前提条件,而对表达在单核细胞上的黏附分子与内皮细胞之间的相互作用的研究是阐明单核细胞迁移机制的关键所在。本文总结了黏附分子在单核细胞的迁移过程中的作用,对其中发挥着关键作用的黏附分子进行重点阐述,以期能为应对炎症疾病所采用的分子靶向治疗提供理论依据或新思路。 展开更多

关键词 单核细胞 迁移 黏附分子 综述

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肠道病毒71型诱导人脑微血管内皮细胞的凋亡 被引量：2

11

作者 罗文英 吴显劲 +4 位作者 彭亮 何肖龙 张立科 张文炳 曹虹 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第13期1359-1364,共6页

目的探讨肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)诱导人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)的凋亡及其相关机制。方法流式细胞仪检测EV71能否诱导HBMECs的凋亡;免疫荧光方法观察EV71诱导HBMECs线粒体膜... 目的探讨肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)诱导人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)的凋亡及其相关机制。方法流式细胞仪检测EV71能否诱导HBMECs的凋亡;免疫荧光方法观察EV71诱导HBMECs线粒体膜电位的改变情况;免疫印迹检测DJ-1蛋白在EV71感染HBMECs不同时间点的表达;酶联免疫方法检测EV71感染HBMECs不同时间点TNF-α、IL-10、IL-4的分泌情况。结果 EV71感染HBMECs不同时间点的HBMECs的早期凋亡数与晚期凋亡、坏死细胞数具有显著差异(P<0.01);随着感染时间延长,HBMECs早期凋亡数与晚期凋亡、坏死细胞数均有所增加,但以晚期凋亡、坏死细胞数增加更明显(P<0.01)。与对照组相比,EV71感染HBMECs8 h线粒体膜电位明显降低(P<0.01);EV71感染HBMECs 16、24 h,DJ-1表达增强(P<0.05)。EV71感染HBMECs不同时间点TNF-α、IL-10、IL-4的浓度具有明显差异(P<0.01)。结论 EV71能诱导HBMECs的凋亡以及改变线粒体膜通透性,EV71还能诱导HBMECs中DJ-1的表达改变和TNF-α、IL-10、IL-4的分泌改变。 展开更多

关键词 肠道病毒71型 人脑微血管内皮细胞 凋亡 DJ-1 细胞因子

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尿路致病性大肠杆菌外膜蛋白T的致病机制 被引量：2

12

作者 屈娅荣 何肖龙 +5 位作者 王勤 张立科 龙敏 罗军 张文炳 曹虹 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期174-179,共6页

目的探讨大肠杆菌外膜蛋白T(OmpT)参与尿路致病性大肠杆菌致病的机制。方法通过建立人膀胱癌移行上皮细胞模型,检测野生株CFT073、ompT基因敲除株COTD、回补株COTD(pST)的体外黏附情况;比较野生株、敲除株和回补株对细胞外基质的体外黏... 目的探讨大肠杆菌外膜蛋白T(OmpT)参与尿路致病性大肠杆菌致病的机制。方法通过建立人膀胱癌移行上皮细胞模型,检测野生株CFT073、ompT基因敲除株COTD、回补株COTD(pST)的体外黏附情况;比较野生株、敲除株和回补株对细胞外基质的体外黏附能力;通过荧光定量PCR方法,比较ompT基因敲除以后,iha和iroN基因的mRNA表达水平;建立小鼠动物模型,比较有无OmpT菌株所致小鼠膀胱和肾脏的细菌载量、血液菌浓度及炎症因子IL-6和IL-8的蛋白表达水平,验证OmpT的致炎作用。结果野生株细胞黏附率为(8.81±1.13)%,敲除株为(4.62±0.39)%,敲除株的黏附率明显低于野生株(P<0.05);野生株的细胞外基质黏附率为(8.85±0.79)%,敲除株为(4.95±0.59)%,敲除株的黏附率明显低于野生株(P<0.05);与敲除株比较,iha和iroN基因在野生株中的表达水平分别是敲除株的2.1和3.8倍;野生株感染的小鼠膀胱组织中细菌载量均数为6.36±0.06,敲除株为6.01±0.07,回补株为6.29±0.06,野生株感染的小鼠肾脏组织中细菌载量为6.25±0.05,敲除株为5.87±0.06,差异均有统计学意义(P<0.05);野生株和回补株所致小鼠膀胱和肾脏组织炎症中IL-6检出的阳性率分别为60%和50%,而ompT基因敲除株则为12.5%。IL-8的表达情况同IL-6。结论初步证实OmpT通过发挥毒力因子的作用,从而影响尿路致病性大肠杆菌对宿主细胞的黏附,其可能机制是影响细菌对细胞外基质的黏附和参与iha和iroN基因的表达并在致炎过程中发挥重要作用。 展开更多

关键词 尿路致病性大肠杆菌 基因敲除 黏附

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肠上皮细胞中大肠杆菌侵袭素IbeA结合蛋白的分离 被引量：1

13

作者 惠长野 郭妍 +3 位作者 李珺 郝小燕 曹虹 黄胜和 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期2375-2378,共4页

目的分离肠上皮Caco-2细胞中与IbeA相互作用的蛋白。方法表达并纯化重组IbeA,将1、5、10μg/ml的His-IbeA及牛血清白蛋白与Caco-2单层细胞4℃孵育30min后,在37℃利用庆大霉素保护实验测定各组大肠杆菌K1致病株E44侵袭率的变化。裂解Cac... 目的分离肠上皮Caco-2细胞中与IbeA相互作用的蛋白。方法表达并纯化重组IbeA,将1、5、10μg/ml的His-IbeA及牛血清白蛋白与Caco-2单层细胞4℃孵育30min后,在37℃利用庆大霉素保护实验测定各组大肠杆菌K1致病株E44侵袭率的变化。裂解Caco-2得全细胞蛋白,上样至结合有His-IbeA的金属离子螯和柱,His pull down纯化特异性结合蛋白,电泳分析,Far-Western blotting进行两者结合特异性的验证,并分析结合蛋白N末端氨基酸序列。结果重组IbeA阻断E44侵袭Caco-2,并呈一定剂量依赖关系,对照组BSA对侵袭没有显著影响。His pull down的方法纯化出两个结合条带,Far-Western blotting验证了结合的特异性。并测定强结合条带pI约5.0,N端序列为MASITKLP。结论分离得到两个与IbeA相互作用的蛋白,为研究IbeA分子致病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 CACO-2细胞 IbeA蛋白 侵袭 结合蛋白 纯化

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登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定 被引量：1

14

作者 贡树基 曹虹 +3 位作者 赵卫 张文炳 周浩 陈丽丹 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期469-471,共3页

目的构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆,为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物,从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术扩增出覆盖病毒基因组... 目的构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆,为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物,从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段,并克隆至pCR-XL-TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明,获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。 展开更多

关键词 登革2型病毒 RT-PCR CDNA克隆

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CXCR4特异性拮抗剂SDF-1P2G54的构建及活性评价 被引量：1

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作者 杨飞华 龙北国 +2 位作者 谭毅 龚雅 马伟峰 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期55-60,共6页

目的对SDF-1进行遗传改造,将其第2位氨基酸由脯氨酸(P)突变为甘氨酸(G),且缺失其C-端α螺旋结构,以获得一种CXCR4特异性拮抗剂SDF-1P2G54。方法将PCR扩增的SDF-1突变体SDF-1p2g54的基因插入表达载体pET-30a(+),并转化BL21(DE3)菌株。IPT... 目的对SDF-1进行遗传改造,将其第2位氨基酸由脯氨酸(P)突变为甘氨酸(G),且缺失其C-端α螺旋结构,以获得一种CXCR4特异性拮抗剂SDF-1P2G54。方法将PCR扩增的SDF-1突变体SDF-1p2g54的基因插入表达载体pET-30a(+),并转化BL21(DE3)菌株。IPTG诱导表达的重组蛋白SDF-1P2G54在变性条件下采用镍柱亲和层析纯化,并通过梯度稀释和超滤方法得以复性。利用趋化实验鉴定SDF-1P2G54对Jurkat细胞的趋化活性及对SDF-1趋化活性的抑制效应,流式细胞仪检测SDF-1P2G54诱导MOLT4细胞钙内流及细胞表面CXCR4内在化的能力。结果 SDF-1P2G54完全丧失激活CXCR4、趋化Jurkat细胞跨膜迁移和诱导MOLT4细胞钙内流的能力,却保持了与CXCR4的高亲和性,能有效抑制野生型SDF-1对Jurkat的趋化效应、诱导MOLT4细胞表面CXCR4的快速内在化。结论 SDF-1P2G54是一种新型的CXCR4特异性拮抗剂,具有开发成抑制HIV-1感染和癌细胞转移等重大疾病特效药物的潜在应用价值。 展开更多

关键词 基质细胞衍生因子-1 CXCR4 拮抗剂 SDF-1P2G54

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肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 espF基因缺陷突变株的构建及其特性初步研究 被引量：1

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作者 杨瑜 王春晖 +1 位作者 周莹 万成松 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期654-658,共5页

目的为研究肠出血性大肠埃希菌O157∶H7效应分子EspF功能,构建EHECO157∶H7espF基因缺陷突变株,并对其生物学特性进行初步研究。方法采用OL-PCR和自杀性质粒pCVD442介导的同源重组方法构建中间缺失162bp的espF基因缺陷突变株,并比较突... 目的为研究肠出血性大肠埃希菌O157∶H7效应分子EspF功能,构建EHECO157∶H7espF基因缺陷突变株,并对其生物学特性进行初步研究。方法采用OL-PCR和自杀性质粒pCVD442介导的同源重组方法构建中间缺失162bp的espF基因缺陷突变株,并比较突变株与野生株对结肠癌细胞Lovo的黏附性。结果 PCR及序列分析证实,缺陷突变株的espF基因缺失了162bp碱基,野生株对Lovo细胞的黏附率明显高于突变株(P<0.001)。结论成功构建EHECO157∶H7espF基因缺陷突变株,突变株黏附Lovo细胞能力减弱,表明EspF促进细菌的粘附,为进一步研究其在EHECO157∶H7的A/E损伤中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 出血性大肠埃希菌 espF 自杀性质粒 同源重组

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HIV-1gp41胞外域对新生隐球菌致人脑微血管内皮细胞骨架改变的影响 被引量：3

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作者 龙敏 曹虹 Ambrose Jong 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期478-481,共4页

目的探讨HIV-1 gp41胞外域gp41-I90肽对新生隐球菌致人脑微血管内皮细胞骨架改变的影响。方法以人脑微血管内皮细胞作为体外血脑屏障模型,在细胞培养玻片或transwell小室上长成单层,用HIV-1 gp41-I90预处理后,再用新生隐球菌感染细胞单... 目的探讨HIV-1 gp41胞外域gp41-I90肽对新生隐球菌致人脑微血管内皮细胞骨架改变的影响。方法以人脑微血管内皮细胞作为体外血脑屏障模型,在细胞培养玻片或transwell小室上长成单层,用HIV-1 gp41-I90预处理后,再用新生隐球菌感染细胞单层,免疫荧光方法检测细胞骨架蛋白actin(肌动蛋白)和filamin(肌动蛋白连接蛋白)的形态变化,并测定gp41-I90处理的人脑微血管内皮细胞单层对辣根过氧化物酶和新生隐球菌的通过率。结果 gp41-I90能明显增强新生隐球菌所致的人脑微血管内皮细胞骨架蛋白actin和filamin的改变,actin和filamin的丝状排列扭曲,纹理稀疏;gp41-I90处理的人脑微血管内皮细胞单层通透性增强,对辣根过氧化物酶和新生隐球菌的通过率明显增加。结论 HIV-1 gp41胞外域gp41-I90肽促进新生隐球菌黏附和侵入血脑屏障,与其增强新生隐球菌所致人脑微血管内皮细胞骨架改变有关。 展开更多

关键词 HIV-1gp41 新生隐球菌 人脑微血管内皮细胞

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多表位HBV DNA疫苗的中试制备及质量研究 被引量：1

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作者 郭妍 惠长野 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期118-120,共3页

目的建立多表位HBVDNA疫苗(PVAX-HS)的中试制备及质量控制方法。方法采用分批补料发酵方式,碱裂解结合超滤浓缩,三步柱层析制备DNA疫苗,并对终产品进行全面质量控制。结果分批补料发酵获得生物量50～60g/L,质粒最终产量约为1.0mg/g菌体... 目的建立多表位HBVDNA疫苗(PVAX-HS)的中试制备及质量控制方法。方法采用分批补料发酵方式,碱裂解结合超滤浓缩,三步柱层析制备DNA疫苗,并对终产品进行全面质量控制。结果分批补料发酵获得生物量50～60g/L,质粒最终产量约为1.0mg/g菌体,符合药用DNA疫苗质量标准。结论建立了质量稳定的PVAX-HS中试制备工艺,符合规模化生产要求。 展开更多

关键词 PVAX-HS DNA疫苗 制备 质量研究

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幽门螺杆菌napA基因的克隆、表达及免疫反应性分析

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作者 罗军 龙北国 +4 位作者 李妍 赖建平 胡平 张文炳 龙敏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期395-398,共4页

目的构建高效表达幽门螺杆菌（Hp）中性粒细胞激活蛋白（NAP）的原核表达系统,为Hp候选疫苗研制打下基础。方法从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增napA基因片段,T-A克隆后测序,与GenBank公布的其他Hp菌株的napA基因序列进行比较。目的... 目的构建高效表达幽门螺杆菌（Hp）中性粒细胞激活蛋白（NAP）的原核表达系统,为Hp候选疫苗研制打下基础。方法从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增napA基因片段,T-A克隆后测序,与GenBank公布的其他Hp菌株的napA基因序列进行比较。目的基因片段酶切后,与表达载体连接,转化至宿主菌,构建napA基因原核表达系统pGEX-4T-1-napA-E.coli Top10。优化诱导表达条件,采用SDS-PAGE鉴定表达产物,GST亲和层析纯化收集重组NAP蛋白,Western blot法鉴定重组NAP的免疫性;采用ELASA法检测胃癌患者Hp阳性血清中抗NAP抗体效价,通过间接ELASA法从29株小鼠抗Hp全菌单克隆抗体（mAb）中筛选抗Hp-NAP mAb。结果所克隆的napA基因全长为435bp,在GenBank上登录（No.DQ341279）,与GenBank公布的其他Hp菌株的核苷酸同源性为94%～98%,与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97%,表达的NAP融合蛋白的相对分子质量（Mr）为44000,1mmol/L浓度IPTG诱导4h表达产物量较高,表达产物可被Hp感染患者的血清及兔抗Hp全菌抗体特异性结合,胃癌患者血清中抗NAP抗体效价高于正常人群血清,29株小鼠抗Hp全菌mAb中有3株mAb能与NAP发生强免疫反应。结论成功构建napA基因高效可溶性原核表达系统,重组NAP具有良好的免疫反应性,NAP在胃癌患者血清中高表达可能与胃癌的发病有关,NAP是具有良好前景的抗原。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 NAP 克隆 基因表达 免疫反应

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血小板活化因子受体在伴放线放线杆菌致病过程中的作用

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作者 王勤 轩东英 +4 位作者 钟德钰 屈娅荣 余晶仪 曹虹 章锦才 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期73-77,共5页

目的研究血小板活化因子受体(PAFR)在磷脂酰胆碱(PC)阳性伴放线放线杆菌(Aa)黏附侵袭人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)过程中的作用。方法利用PAFR拮抗剂(CV3988)和抗PAFR抗体作用于HUVEC 30 min后,观察PC阳性Aa对HUVEC黏附和侵袭的影响;并... 目的研究血小板活化因子受体(PAFR)在磷脂酰胆碱(PC)阳性伴放线放线杆菌(Aa)黏附侵袭人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)过程中的作用。方法利用PAFR拮抗剂(CV3988)和抗PAFR抗体作用于HUVEC 30 min后,观察PC阳性Aa对HUVEC黏附和侵袭的影响;并采用MTT法分析PC阳性和阴性Aa诱导细胞损伤的情况。结果采用100、200、500 nmol/L的PAFR拮抗剂预处理HUVEC,显著减少了PC阳性Aa对HUVEC的黏附和侵袭(P<0.001),黏附率分别为对照组的(36.29±3.52)%,(19.04±3.35)%和(7.69±3.19)%;侵袭率分别为对照组的(12.12±1.58)%,(7.08±0.29)%和(2.60±2.26)%。用抗PAFR抗体预处理HUVEC后Aa对HUVEC的黏附率和侵袭率分别为(50.05±5.28)%和(39.09±6.50)%,显著降低了Aa对宿主细胞的黏附和侵入(P<0.001)。采用200 nmol/L和500 nmol/L的PAFR拮抗剂和25μg/m L抗PAFR抗体预处理HUVEC后,PC阳性的Aa与细胞作用以后,细胞的存活率显著升高(P<0.001),从(25.39±9.33)%分别升高到(91.12±3.14)%,(94.12±2.15)%和(65.5±1.87)%。而PC阴性的Aa菌株中,预处理组与未预处理的组相比,细胞活力并没有显著增加(P>0.05)。结论我们发现PAFR在PC阳性的Aa对宿主细胞的粘附、侵袭及诱导胞死亡的过程中发挥了重要作用。 展开更多

关键词 伴放线放线杆菌 血小板活化因子受体 人脐静脉血管内皮细胞 黏附率 侵袭率

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