重组人尿激酶原药效学研究 被引量：9

1

作者 赵专友 刘蓓钫 +3 位作者 刘厚孝 孙自勇 张菁 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期420-434,共15页

利用人血浆及其产生的血栓凝块 ,在试管中模拟纤溶酶原激活剂在体内引起血栓溶解的过程及麻醉开胸犬电刺激冠脉左旋支引起的冠脉血栓形成模型评价重组人尿激酶原的溶栓活性 ,并与尿激酶进行比较 .InVitro实验结果表明 :2 4 0IU /mL是 pr... 利用人血浆及其产生的血栓凝块 ,在试管中模拟纤溶酶原激活剂在体内引起血栓溶解的过程及麻醉开胸犬电刺激冠脉左旋支引起的冠脉血栓形成模型评价重组人尿激酶原的溶栓活性 ,并与尿激酶进行比较 .InVitro实验结果表明 :2 4 0IU /mL是 prouk血纤维蛋白专一的最大浓度 ,低浓度的重组prouk比天然 prouk具有更高的溶栓能力 ,这可能与其非糖基化结构有关 .当重组prouk浓度小于 1μg/mL时 ,它在血浆中几乎不降解任何纤维蛋白原 .犬静脉给予重组人尿激酶原 9× 10 4 、4 .5× 10 4 、2 .2 5× 10 4 IU·kg- 1 对冠脉血栓产生显著的溶栓效果 ,栓塞冠脉血管很快出现再通 ,残存血栓较溶剂对照分别减少了 6 9.2 %、5 7.0 %、4 3.1% ;心肌梗死范围明显缩小 ;与等剂量尿激酶溶栓作用相似 .血浆优球蛋白溶解时间明显缩短 ;溶栓不伴有明显的血浆纤维蛋白原降解 ,而尿激酶溶栓的同时 ,纤维蛋白原明显降低 .除高剂量组个别动物外 ,对伤口出血量增加出血时间无明显影响 . 展开更多

关键词 重组人尿激酶原 溶栓治疗 纤维蛋白原 药效学 血栓 溶栓药

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重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究 被引量：5

2

作者 陈于红 孙自勇 +4 位作者 朱镇华 张菁 傅一工 朱德煦 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期407-415,共9页

将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport... 将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 . 展开更多

关键词 重组人尿激酶原 发酵 活化 纯化 工业化制备 基因重组技术 IPIG诱导表达

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尿激酶原活性测定方法研究 被引量：4

3

作者 张菁 朱镇华 +2 位作者 刘莉莉 刘建宁 朱德煦 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期416-419,共4页

以双链尿激酶国际标准品 (IS)为对照 ,用显色底物法和凝块溶解法测定糖基化和非糖基化的尿激酶原的酶活性 ,结果表明与凝块法相比 ,显色底物法测定两种形式的尿激酶原的酶活力相近 ,测量误差小 ,重复性好 。

关键词 尿激酶原 显色底物法 凝块溶解法 酶活性 活性测定 纤维蛋白选择性纤溶酶原激活剂

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重组人尿激酶原一般药理学研究 被引量：3

4

作者 方泰慧 张菁 +4 位作者 张培祥 朱德煦 徐立 刘建宁 刘蓓钫 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期452-457,共6页

试验结果显示 :尿激酶原 (prouk) 2 2 .5万IU/kg、4 5 .0万IU/kg和 90 .0万IU/kg3个组、赋形剂组和生理盐水组动物尾静脉注射给药 ,对小鼠一般行为活动表现和自发活动次数均无明显影响 .prouk 2 2 .5万IU/kg、4 5 .0万IU/kg和 90 .0万IU... 试验结果显示 :尿激酶原 (prouk) 2 2 .5万IU/kg、4 5 .0万IU/kg和 90 .0万IU/kg3个组、赋形剂组和生理盐水组动物尾静脉注射给药 ,对小鼠一般行为活动表现和自发活动次数均无明显影响 .prouk 2 2 .5万IU/kg、4 5 .0万IU/kg和 90 .0万IU/kg三个组、赋形剂组和生理盐水组动物尾静脉注射给药 ,对大鼠一般行为活动表现均无明显影响 ,均能在旋转棒上协调平衡运动 .此外 ,给药后 2 0min ,三个剂量组大鼠凝血时间虽有延长 ,但与生理盐水组或赋形剂组比较无显著性差异 (P >0 .0 5 ) .prouk 11.2 5万IU/kg、2 2 .5 0万IU /kg、4 5 .0 0万IU/kg三组静脉滴注给药 ,麻醉犬的ECG、HR、呼吸均无明显改变 ,与赋形剂组比较无显著性差异 .但prouk高剂量组动物的SAP、DAP、MAP在给药 10～ 15min时短暂下降 ,这些反应在给药 30min后均恢复正常 .结果表明 ,prouk在受试剂量范围内对小鼠、大鼠精神神经活动和大鼠的凝血时间等均无明显影响 ,在 4 5 .0 展开更多

关键词 重组人尿激酶原 药理学 凝血时间 溶栓药物 基因重组技术 神经系统 心血管系统

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重组人尿激酶原急性毒性和长期毒性的研究 被引量：2

5

作者 张培祥 刘蓓钫 +8 位作者 方泰慧 张菁 徐立 陈于红 罗炳辉 孙自勇 杨世华 朱德煦 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期458-472,共15页

(1)重组人尿激酶原 (prouk)单剂量分别经静脉和腹腔注射给药均未测出小鼠的LD50 ,因此改作其最大给药量 .结果表明 ,prouk单剂量经静脉及腹腔注射给药小鼠的最大给药量不低于 9,0 0 0万IU /kg .(2 ) prouk 36 .0万IU/kg、6 7.5万IU/kg、... (1)重组人尿激酶原 (prouk)单剂量分别经静脉和腹腔注射给药均未测出小鼠的LD50 ,因此改作其最大给药量 .结果表明 ,prouk单剂量经静脉及腹腔注射给药小鼠的最大给药量不低于 9,0 0 0万IU /kg .(2 ) prouk 36 .0万IU/kg、6 7.5万IU/kg、135 .0万IU/kg和 2 70 .0万IU/kg四个剂量组连续给食蟹猴静脉滴注 14d ,每组 4只猴 ,雌雄各半 .实验过程中未见动物死亡 .prouk 36 .0万IU/kg剂量组的食蟹猴给药期及恢复期 ,精神状态良好 ,一般行为活动正常 ,体重、分泌物、食欲及摄食量、心电图、血常规、血液生化、体表观察、尿常规和粪便隐血试验等基本正常 ,无明显变化 .给药第 14天和恢复期的脏器系数与病理组织学检查表明 ,动物的脏器、组织均未见由药物引起的异常病理改变 ,与生理盐水组或赋形剂组之间比较均无明显差异 .而prouk 6 7.5万IU/kg、135 .0万IU/kg、2 70 .0万IU /kg剂量组的食蟹猴出现皮下出血、充血、紫癜、尿、粪便隐血反应阳性、贫血以及心率加快等症状 .给药期及恢复期 ,血清中检测出少量prouk抗体 .结果表明 ,prouk的无毒安全剂量不低于 36 .0万IU/kg . 展开更多

关键词 重组人尿激酶原 急性毒性 长期毒性 溶栓药物 毒性反应 安全剂量

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究 被引量：1

6

作者 朱镇华 孙自勇 +7 位作者 陈于红 张菁 王石泉 杨庆 刘莉莉 丁楅森 陈新园 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期7-15,共9页

　将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得... 　将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95%以上,比活大于500000IU/mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准.其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符.同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究. 展开更多

关键词 重组人组织型纤溶酶原激活剂 缺失变体 制备 发酵 活化 纯化 蛋白

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解耦联蛋白2的研究进展 被引量：1

7

作者 张春妮 刘畅 汪俊军 《医学研究生学报》 CAS 2004年第9期832-834,共3页

解耦联蛋白 2 (UCP2 )是一种新的解偶联蛋白 ,在体内广泛分布 ,主要功能是控制ATP合成。UCP2参与肥胖和糖尿病发展 ,在组织中过表达以及基因启动子 - 86 6G/A多态性与肥胖者的 β 细胞功能和糖尿病危险有关。

关键词 解耦联蛋白2 多态性 肥胖 2型糖尿病

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究

8

作者 赵专友 刘厚孝 +5 位作者 张菁 陈于红 张巍 朱镇华 王石泉 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期16-27,共12页

　犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%... 　犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用. 展开更多

关键词 重组人组织型纤溶酶原激活剂 缺失变体 药效学 溶栓 纤维蛋白原 血小板聚集 心脑血管病

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重组人尿激酶原药代动力学的研究 被引量：10

9

作者 刘秀文 孙自勇 +7 位作者 窦桂芳 朱镇华 袁守军 陈于红 张菁 刘建宁 汤仲明 刘蓓钫 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期435-451,共17页

第一部分 :采用交叉设计 ,自身比较 ,研究了猕猴静脉注射 0 .4 ,0 .8和 3.2mg·kg- 1 重组人尿激酶原 (rhprouk)或 1.2 8× 10 5IU·kg- 1 尿源性天然尿激酶 (un UK) (其中推注 15 %剂量 ,90min内恒速滴注 85 %剂量 )后血... 第一部分 :采用交叉设计 ,自身比较 ,研究了猕猴静脉注射 0 .4 ,0 .8和 3.2mg·kg- 1 重组人尿激酶原 (rhprouk)或 1.2 8× 10 5IU·kg- 1 尿源性天然尿激酶 (un UK) (其中推注 15 %剂量 ,90min内恒速滴注 85 %剂量 )后血浆中单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scu PA)和双链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (tcu PA)的浓度随时间变化、代谢转化和各自的药代动力学 ,及代谢转化和药代动力学参数与剂量浓度的依赖关系 .结果表明给药后scu PA转化为tcu PA的速度与scu PA的剂量呈正相关性 .第二部分 :通过测定兔静脉推注加滴注1 2 5I rhprouk 0 .8mg·kg- 1 (其中 15 %剂量静脉推注 ,85 %剂量在 90min内滴注 ,比放射活性 2 .5 0 6MBq/mg)后不同时间体内各组织总放射性、TCA酸沉放射性 ,以及酸沉和总放射性的比值 ;胆汁引流物放射性累计排出量 ,尿和粪中累计排出量 ,及在体内外1 2 5I rhprouk与血浆蛋白的结合 .研究rhprouk在体内的分布、代谢及排泄情况 .结果表明rhprouk不与血浆中蛋白结合 ,代谢部位主要集中在胆、肾等部位 ,代谢产物主要随小便排出 . 展开更多

关键词 重组人尿激酶原 代谢转化 药代动力学 纤溶酶原激活剂 代谢产物 溶栓药物 注射剂量

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一种具有抗肿瘤活性的新型尿激酶原Kringle结构域变体蛋白的研究 被引量：1

10

作者 曹中炜 丁楅森 +6 位作者 陈新园 周颖江 王石泉 张菁 朱镇华 陈于红 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期28-33,共6页

　利用PCR技术获得人尿激酶原Kringle结构域基因,将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中,并进而插入plasminogenKringle5一段16肽片段构建了其变体,重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,其产物以包涵体形式存在.通过体外复... 　利用PCR技术获得人尿激酶原Kringle结构域基因,将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中,并进而插入plasminogenKringle5一段16肽片段构建了其变体,重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,其产物以包涵体形式存在.通过体外复性,得到可溶性的prourokinaseKringle及其变体.所得蛋白质经过动物肿瘤模型测活,确定变体蛋白具有抑制肿瘤生长作用. 展开更多

关键词 抗肿瘤活性 尿激酶原Kringle结构域基因 变体蛋白 抑制疗法

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人血小板多态性抗原HPA-1a/HPA-1b在CHO细胞中的表达及功能研究

11

作者 陈平 杨文 +2 位作者 孙崇秀 秦朝平 Nelly Kieffer 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期559-565,共7页

为了在体外研究HPA-1抗原的多态性,同时建立一种更简便灵敏的检测抗HPA-1同种(异型)抗体的方法,将含有HPA-1a和HPA-1b的DNA质粒分别转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)并获得稳定表达β_3HPA-1a和β_3HPA-1b的细胞株。流式细胞分析结果表明,... 为了在体外研究HPA-1抗原的多态性,同时建立一种更简便灵敏的检测抗HPA-1同种(异型)抗体的方法,将含有HPA-1a和HPA-1b的DNA质粒分别转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)并获得稳定表达β_3HPA-1a和β_3HPA-1b的细胞株。流式细胞分析结果表明,CHO细胞结合抗HPAPA-1a同种(异型)抗体的能力与细胞表面β_3整合素表达量直接相关。同时,针对HPA-1a表位的单克隆抗体SZ21仅能抑制CHOβ_3HPA-1a细胞的粘附,对 CHOβ_3HPA-1b细胞却没有影响。抗HPA-1a参照血清能阻断CHOβ_3HPA-1a细胞的粘附,但对CHOβ_3HPA-1b细胞却影响甚微。结果表明,CHO细胞模型可以成功地用来表达并研究HPA-1a的多态性及其抗原特性,同时可以作为用于临床检测抗HPA-1a同种(异型)抗体的一种替代方法。 展开更多

关键词 人血小板抗原 HPA 整合素 同种(异型)抗体

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牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定 被引量：12

12

作者 孙自勇 陈均勇 +4 位作者 陈新园 汪晶 田鹏鹏 吴盛 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期41-48,共8页

　用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sephar... 　用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶. 展开更多

关键词 肠激酶 毕赤酵母 分泌表达 纯化 酶切 免疫印迹 丝氨酸蛋白水解酶

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重组人尿激酶原基因的克隆及工程菌的构建与鉴定 被引量：5

13

作者 陈于红 张菁 +2 位作者 朱镇华 傅一工 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期401-406,共6页

利用RT PCR技术 ,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因 ,用表达质粒pET2 9a构建了重组质粒 pET2 9a/ prouk ,并转化至大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,作为工程菌 .经IPTG诱导表达 ,在 4 6kDa处有一明显表达条带 ,表达量为约占菌体总... 利用RT PCR技术 ,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因 ,用表达质粒pET2 9a构建了重组质粒 pET2 9a/ prouk ,并转化至大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,作为工程菌 .经IPTG诱导表达 ,在 4 6kDa处有一明显表达条带 ,表达量为约占菌体总蛋白的 2 0 % . 展开更多

关键词 重组人尿激酶原基因 工程菌 质粒稳定性 表达稳定性 基因克隆 菌株表达

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人纤溶酶原Kringle 5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定 被引量：3

14

作者 陈浩 陈于红 +2 位作者 张菁 刘建宁 朱德煦 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期218-222,共5页

根据人纤溶酶原的cDNA序列 ,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle 5结构域的基因 ,并将其克隆至表达质粒 pET2 5b(+)中 .重组载体 pET2 5b(+) /kringle 5转化至大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,在 12kD处可见明显的表达条带 ,表达... 根据人纤溶酶原的cDNA序列 ,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle 5结构域的基因 ,并将其克隆至表达质粒 pET2 5b(+)中 .重组载体 pET2 5b(+) /kringle 5转化至大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,在 12kD处可见明显的表达条带 ,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在 .包涵体经过体外变复性 ,SP SepharoseFF离子交换柱一步纯化 ,15%SDS PAGE鉴定考染一条带 ,纯度达 95%以上 .所得到的目标蛋白能明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生 . 展开更多

关键词 血管生成抑制素 KRINGLE5 包涵体 人纤溶酶原基因 克隆 表达 纯化 鉴定 肿瘤治疗

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重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定 被引量：4

15

作者 孙自勇 朱镇华 +5 位作者 陈均勇 刘莉莉 张巍 杨庆 张菁 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2004年第1期34-40,共7页

人脑钠素(hBNP，human brain natriuretic peptide)是心室分泌的由32个氨基酸组成的多肽激素．临床研究表明，hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物．化学合成脑钠素全基因，以pET32a为表达载体，构建了硫氧还蛋白-脑钠素(th... 人脑钠素(hBNP，human brain natriuretic peptide)是心室分泌的由32个氨基酸组成的多肽激素．临床研究表明，hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物．化学合成脑钠素全基因，以pET32a为表达载体，构建了硫氧还蛋白-脑钠素(thioredoxin—hBNP)融合蛋白表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，融合蛋白的表达量占全菌蛋白量的25％以上．融合蛋白经肠激酶裂解、Zn—Sepharose亲和层析和C4反相高效液相层析，从每升培养液中可获取4mg rhBNP，纯度达到95％．经质谱测定，rhBNP样品的分子量为3464Da．体外活性测定结果表明，rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应，其ED50为(2．24±0．58)×10^-6mg／mL． 展开更多

关键词 重组人脑钠素 大肠杆菌 表达 纯化 鉴定 肠激酶 酶解 多肽激素

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固相合成抗凝血药比伐卢定及合成条件的优化 被引量：3

16

作者 沈忱 刘建宁 +2 位作者 王莹 邓华玲 唐艳春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1282-1286,共5页

目的:研究使用Wang树脂与Fmoc保护策略固相合成抗凝血药比伐卢定(bivalirudin)的实验方法。方法:比伐卢定的合成经过了逐步偶联、TFA裂解、脱保护、HPLC纯化等一系列步骤。为了优化反应条件,选择了不同氨基酸取代度的树脂(0.29、0.48、0... 目的:研究使用Wang树脂与Fmoc保护策略固相合成抗凝血药比伐卢定(bivalirudin)的实验方法。方法:比伐卢定的合成经过了逐步偶联、TFA裂解、脱保护、HPLC纯化等一系列步骤。为了优化反应条件,选择了不同氨基酸取代度的树脂(0.29、0.48、0.59mmol/g)和不同的缩合试剂(HBTU、DCC、HATU)进行试验。结果:成功得到了纯度为98%的比伐卢定。活性测定表明,不同方法合成的比伐卢定均具有与标准样品相当的抗凝活性,并且显示:①氨基酸取代度为0.3～0.4mmol/g的Wang树脂可以得到产率及纯度均较高的产品,取代度太大(>0.5mmol/g)得到的产品副产物多、纯度低;②用HBTU/HOBt为缩合试剂具有操作方便、成本经济、合成效率高等优点。根据以上实验结果选择优化条件,用5gWang树脂合成克级单位的比伐卢定,得到的粗品产率可达84%,纯度可达68%以上。结论:通过固相合成的方法,考察了不同氨基酸取代度、不同缩合试剂及规模大小对合成比伐卢定的产率、纯度及活性的影响,对比伐卢定的大量合成具有一定的指导作用。 展开更多

关键词 凝血酶 固相合成 比伐卢定 缩合试剂 取代度

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重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定 被引量：2

17

作者 陈于红 朱镇华 +6 位作者 刘蓓钫 张菁 傅一工 王石泉 张巍 杨庆 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期1-6,共6页

　利用RT PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2.1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重... 　利用RT PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2.1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a/K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌.经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20%.该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性. 展开更多

关键词 组织型人纤溶酶原激活剂变体基因 工程菌 质粒稳定性 表达稳定性 克隆

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重组人尿激酶原氨基末端片段的制备及活性测定 被引量：1

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作者 汪晶 陈新园 +3 位作者 孙自勇 姚宏伟 陈均勇 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期66-74,共9页

　尿激酶原的N 末端135个氨基酸片段包含了表皮生长因子结构域和环柄结构域,参与了尿激酶原和其受体的结合以及尿激酶原诱导的化学趋化活性.利用RT PCR,从人脐带静脉内皮细胞中克隆ATF基因.将ATF基因插入pET 29a(+)中构建表达质粒pET 29... 　尿激酶原的N 末端135个氨基酸片段包含了表皮生长因子结构域和环柄结构域,参与了尿激酶原和其受体的结合以及尿激酶原诱导的化学趋化活性.利用RT PCR,从人脐带静脉内皮细胞中克隆ATF基因.将ATF基因插入pET 29a(+)中构建表达质粒pET 29a(+)/ATF,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达及纯化后,从每升培养液中获得15mgrhATF,其纯度超过95%.活性测定结果表明rhATF能够阻断尿激酶原与尿激酶受体的结合,并能抑制尿激酶对纤溶酶原以及纤溶酶对尿激酶原的激活. 展开更多

关键词 ATF 尿激酶受体 纯化 抑制 制备 活性测定 多肽

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尿激酶原激活是其催化纤溶酶原激活的限速步骤(英文) 被引量：1

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作者 陈于红 张菁 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期489-495,共7页

尿激酶原催化纤溶酶原的激活包括3个反应:(1)尿激酶原内在酶活性催化纤溶酶原转化为纤溶酶;(2)纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶;(3)尿激酶激活纤溶酶原,所以一直以来人们对尿激酶原激活纤溶酶原的过程知之甚少.研究发现EACA可以抑制尿激... 尿激酶原催化纤溶酶原的激活包括3个反应:(1)尿激酶原内在酶活性催化纤溶酶原转化为纤溶酶;(2)纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶;(3)尿激酶激活纤溶酶原,所以一直以来人们对尿激酶原激活纤溶酶原的过程知之甚少.研究发现EACA可以抑制尿激酶原催化的纤溶酶原激活.通过EACA对上述3个反应的影响进行逐个分析,观察到在EACA浓度为2 .0 mmol/L时,尿激酶原内在酶活性催化纤溶酶原激活的反应速度提高了4 .5倍,尿激酶激活纤溶酶原的反应速度提高了6倍.相反地,纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶的反应被抑制了50 %,此反应决定了EACA对尿激酶原催化纤溶酶原激活反应的抑制作用.该结果提示尿激酶原催化纤溶酶原激活反应的限速步骤是纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶,缘于纤溶酶和尿激酶原的赖氨酸结合位点的相互作用. 展开更多

关键词 尿激酶原 尿激酶 纤溶酶原 激活 赖氨酸结合位点 EACA

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重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

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作者 陈均勇 陈新园 +6 位作者 孙自勇 刘莉莉 朱镇华 汪晶 吴盛 王石泉 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期58-65,共8页

　将化学合成的rhPTH(1 34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET＿35b(+),使rhPTH(1 34)融合于纤维素结合结构域(CBDclos)的羧基端,并得到高效表达.融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经FactorXa裂解释放出rhPTH(1 34),再通过纤维素树... 　将化学合成的rhPTH(1 34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET＿35b(+),使rhPTH(1 34)融合于纤维素结合结构域(CBDclos)的羧基端,并得到高效表达.融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经FactorXa裂解释放出rhPTH(1 34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1 34)纯品.每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1 34).经质谱测定,所得样品的分子量为4117.0Da,与rhPTH(1 34)理论分子量一致. 展开更多

关键词 甲状旁腺激素 大肠杆菌 表达 纯化 纤维素结合结构域 FACTOR Xa

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