人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定 被引量：8

1

作者 李琛 林红 +5 位作者 刘新建 王忠灿 周镇先 陈乐如 管晓虹 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期575-578,616,共5页

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为s... 目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 噬菌体展示 狂犬病毒 人源scFv抗体库

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人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定 被引量：4

2

作者 陈雅 熊四平 +8 位作者 唐奇 王怡雯 耿以如 顾慧 徐亚如 周荧 仇镇宁 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期874-879,892,共7页

目的 :将从全人源Fab噬菌体抗体库筛选获得的抗H7N9血凝素Fab抗体基因进行基因工程改造,以表达全分子抗H7N9血凝素中和抗体Ig G,并验证其对H7N9型禽流感病毒的中和活性。方法:用H7N9型禽流感病毒血凝素筛选全人源Fab噬菌体抗体库,构建... 目的 :将从全人源Fab噬菌体抗体库筛选获得的抗H7N9血凝素Fab抗体基因进行基因工程改造,以表达全分子抗H7N9血凝素中和抗体Ig G,并验证其对H7N9型禽流感病毒的中和活性。方法:用H7N9型禽流感病毒血凝素筛选全人源Fab噬菌体抗体库,构建全分子Ig G抗体重、轻链表达载体,共转染293 Free Style(293F)细胞,表达并纯化Ig G抗体。应用ELISA及Western blot实验检测抗体免疫学活性,微量中和实验及鸡胚预防保护实验检测其中和活性,血凝抑制试验判断其结合血凝素亚基。结果:成功筛选出1株全人源抗H7N9血凝素Fab抗体基因并构建Ig G真核表达载体。获得的全分子Ig G抗体重、轻链序列正确,并可特异性结合H7N9血凝素。微量中和实验证明其对H7N9型禽流感病毒有良好中和活性,中和滴度为15.6μg/m L。鸡胚预防保护实验显示抗体用量为200μg时可达100%保护率。血凝抑制试验表明其结合血凝素HA2亚基。结论:制备的重组全人源全分子抗H7N9血凝素Ig G抗体可特异性识别H7N9型禽流感病毒血凝素,对H7N9型禽流病毒有显著的中和作用,为进一步研发用于禽流感防治的抗体药物奠定基础。 展开更多

关键词 H7N9 全分子抗体 血凝素 中和抗体

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人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选、鉴定 被引量：4

3

作者 万佳艺 孙慧 +4 位作者 焦永军 朱晓娟 朱进 刘政 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期697-701,共5页

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定。方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞,用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库。以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后... 目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定。方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞,用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库。以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstOⅠ酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定。结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26。DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性。结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子。 展开更多

关键词 C-MET 噬菌体抗体库 FAB片段 肿瘤

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人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达及对胰腺癌细胞增殖的抑制作用 被引量：2

4

作者 王欢 刘琼琼 +8 位作者 唐小军 徐鑫 褚楚 熊四平 郑峰 童华 朱进 冯振卿 林红 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期863-869,882,共8页

目的:以人源抗TROP2抗体Fab基因为模板,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG真核表达系统,观察人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞增殖的抑制作用。方法:分别扩增抗TROP2抗体的重链和轻链基因,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG的重组表达载体p... 目的:以人源抗TROP2抗体Fab基因为模板,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG真核表达系统,观察人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞增殖的抑制作用。方法:分别扩增抗TROP2抗体的重链和轻链基因,构建人源抗TROP2全分子抗体IgG的重组表达载体pWS-anti-TROP2,转染CHO dhfr-细胞,加MTX筛选抗体表达量高的单克隆株,Protein G亲和柱纯化,获得人源抗TROP2全分子抗体IgG。SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫荧光和流式细胞术等方法鉴定人源抗TROP2全分子抗体IgG并分析其免疫学活性。MTT法分析人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌细胞BxPC-3的增殖抑制作用。结果:成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,表达并纯化人源抗TROP2全分子抗体IgG。经鉴定,抗体的轻链与重链大小与预期一致,可与TROP2蛋白特异性结合,效价可达1∶6 400。MTT检测结果表明,人源抗TROP2全分子抗体IgG对胰腺癌BxPC3细胞的增殖有明显的抑制作用,且呈时效、量效依赖关系。结论:本研究成功构建了人源抗TROP2全分子抗体IgG的真核表达系统,并证明此抗体可特异性识别胰腺癌细胞表面的TROP2蛋白,且对胰腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用。 展开更多

关键词 TROP2 真核表达系统 CHO dhfr-细胞 胰腺癌

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人源抗EGFR抗体-鱼精蛋白融合蛋白的制备及活性分析 被引量：1

5

作者 张峰 王小英 +5 位作者 唐奇 刘玉 张慧林 苏亦平 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期651-655,共5页

目的:构建人抗EGFR单链抗体(scFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protamine,tP)融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达并纯化,分析该融合蛋白的生物学活性。方法:设计引物扩增人抗EGFR单链抗体编码序列,将其克隆于原核表达载体pBAD-A;人工合成tP序... 目的:构建人抗EGFR单链抗体(scFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protamine,tP)融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达并纯化,分析该融合蛋白的生物学活性。方法:设计引物扩增人抗EGFR单链抗体编码序列,将其克隆于原核表达载体pBAD-A;人工合成tP序列,将其克隆于原核表达载体pBAD-AscFv上,构建成scFv/tP融合基因,在大肠杆菌TOP10F′中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用His-trap镍亲和层析柱纯化。ELISA分析scFv/tP融合蛋白抗原亲合活性,凝胶迁移阻滞实验检测scFv/tP融合蛋白与DNA的结合活性。结果:成功构建了人源抗EGFR抗体/tP融合基因,经L-Ara诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达。表达的scFv/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性,同时具有结合DNA的能力。结论:scFv与tP融合后,同时具有与抗原和DNA结合的活性,该scfv/tP融合蛋白为EGFR表达阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 EGFR 单链抗体:鱼精蛋白

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探讨不同实验条件对U87细胞体外增殖的影响

6

作者 龙卫国 郭泽 +1 位作者 曹伯良 张爱霞 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期632-635,724,共5页

目的:探讨RNA干扰肝癌衍生生长因子(HDGF)后,U87细胞增殖抑制的最佳实验条件。方法:用LipofectamineTM2000将HDGF siRNA转染U87细胞后,将细胞接种于96孔板中,分别在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,采用MTS... 目的:探讨RNA干扰肝癌衍生生长因子(HDGF)后,U87细胞增殖抑制的最佳实验条件。方法:用LipofectamineTM2000将HDGF siRNA转染U87细胞后,将细胞接种于96孔板中,分别在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,采用MTS法检测细胞增殖能力。结果:HDGF表达水平下调后,U87细胞增殖能力受到抑制。在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,细胞增殖抑制率分别是18%、9%和28%。结论:在无血清Matrigel胶预先处理的培养条件下,能最大程度上反映出HDGFsiRNA对U87细胞增殖能力的抑制。 展开更多

关键词 RNA干扰 细胞增殖 培养条件

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抗EB病毒LMP2A单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

7

作者 徐鑫 唐小军 +9 位作者 熊林 王欢 李文杰 高畅 熊四平 仇镇宁 Tan Min Han Vo Jess Honganh 冯振卿 陈仁杰 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期875-882,共8页

目的:利用杂交瘤技术制备抗EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)单克隆抗体并分析其免疫学特性。方法:以LMP第2和第5胞外区表位串联制备的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备抗LMP2A的单克隆抗体。通过ELISA、Wester... 目的:利用杂交瘤技术制备抗EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)单克隆抗体并分析其免疫学特性。方法:以LMP第2和第5胞外区表位串联制备的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备抗LMP2A的单克隆抗体。通过ELISA、Western blot、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术等方法鉴定单抗的免疫学特性。结果:获得1株稳定并持续分泌抗LMP2A单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株,所分泌的单克隆抗体5C12-C4-A6能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面的LMP2A蛋白。结论:本文制备了能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面LMP2A蛋白的单克隆抗体,为进一步进行鼻咽癌临床早期诊断和分子靶向治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 EB病毒 LMP2A 单克隆抗体 免疫学特性

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抗人滋养层细胞表面抗原-2单抗的制备及免疫学特性分析 被引量：6

8

作者 梁洁 刘琼琼 +6 位作者 张慧林 林红 唐奇 刘玉 苏亦平 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期645-650,共6页

目的:利用杂交瘤技术制备抗人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigen 2,Trop2)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性。方法:以胰腺癌细胞系BxPC3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合后制备单抗。通过酶联免疫法、免疫... 目的:利用杂交瘤技术制备抗人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigen 2,Trop2)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性。方法:以胰腺癌细胞系BxPC3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合后制备单抗。通过酶联免疫法、免疫荧光、免疫沉淀和质谱分析、流式细胞术、免疫组织化学等方法,鉴定单抗的免疫学特性。结果:通过细胞的融合与筛选,获得了持续分泌抗Trop2单抗的杂交瘤细胞株,该抗体可以识别细胞表面的Trop2膜蛋白,也可用于免疫组化识别人肿瘤组织中的Trop2蛋白,同时该抗体对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用。结论:该单抗具有作为Trop2阳性表达肿瘤靶向治疗的潜在应用价值。 展开更多

关键词 人滋养层细胞表面抗原-2 单克隆抗体 免疫组化

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非小细胞肺癌VEGFR-2的表达及临床意义 被引量：2

9

作者 谭洋 樊祥山 +5 位作者 孟凡青 石永利 黄剑飞 李玉华 朱进 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1183-1187,共5页

目的:探讨血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其与临床病理特征、预后的关系。方法:采用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测... 目的:探讨血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其与临床病理特征、预后的关系。方法:采用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测VEGFR-2在217例非小细胞肺癌中的表达情况,并结合临床病理资料进行单因素生存分析。结果:VEGFR-2在NSCLC中高表达,阳性率为63.1%,且该基因的表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、神经侵袭有显著相关性(P<0.05)。VEGFR-2的表达与NSCLC的预后相关,阳性表达该基因的患者的平均中位生存期比阴性表达的患者长12个月(P=0.049)。结论:VEGFR-2基因在非小细胞肺癌的发生、发展过程及预后具有重要作用。 展开更多

关键词 VEGFR-2 NSCLC 预后 免疫组化

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HDGF真核表达质粒的构建、表达及其生物活性检测 被引量：2

10

作者 郭泽 龙卫国 +1 位作者 曹伯良 张爱霞 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期602-606,共5页

目的:构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,转入胶质瘤U87细胞中,对其表达及生物学活性进行检测。方法:PCR扩增HDGF编码区序列,构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,脂质体转染U87细胞,G418筛选稳定表达单克隆,荧光显微镜观察绿色荧光,RT-PCR及Westernb... 目的:构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,转入胶质瘤U87细胞中,对其表达及生物学活性进行检测。方法:PCR扩增HDGF编码区序列,构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,脂质体转染U87细胞,G418筛选稳定表达单克隆,荧光显微镜观察绿色荧光,RT-PCR及Westernblot检测融合蛋白在转染细胞中的整合及表达。通过U87细胞增殖实验对HDGF-GFP融合蛋白进行初步功能鉴定。结果:pEGFP-HDGF表达质粒转染U87细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR、Westernblot结果证实在U87细胞中有HDGF-GFP融合蛋白的表达。细胞增殖实验的结果显示,稳定表达pEGFP-HDGF的U87细胞生长速率明显高于对照空载组细胞(P=0.006)。结论:pEGFP-HDGF真核表达质粒构建成功,且HDGF对于胶质瘤U87细胞株有着生长刺激作用,这将有助于胶质瘤发生发展的分子机制研究。 展开更多

关键词 肝癌衍生生长因子 绿色荧光蛋白 U87细胞株

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GRO-α的原核表达及对细胞增殖作用的初步研究 被引量：1

11

作者 陈晓笑 唐奇 +5 位作者 朱进 仇镇宁 李玉华 王祝鸣 管晓虹 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1060-1064,共5页

目的:构建含有GRO-α(生长调节癌基因-1)的重组表达载体,优化重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中表达,分析其对肿瘤细胞的增殖作用的影响。方法:RT-PCR扩增GRO-α基因片段,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western b... 目的:构建含有GRO-α(生长调节癌基因-1)的重组表达载体,优化重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中表达,分析其对肿瘤细胞的增殖作用的影响。方法:RT-PCR扩增GRO-α基因片段,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot检测目的蛋白表达。经亲和层析柱纯化目的蛋白,作用于人乳腺癌细胞系MCF-7,应用CCK8检测其对细胞增殖的影响。结果:成功构建pGEX-4T-1/GRO-α原核表达质粒,高效表达GRO-α-GST融合蛋白,大小为34ku。细胞增殖实验结果显示,该蛋白对人乳腺癌细胞MCF-7增殖具有促进作用。结论:重组GRO-α-GST融合蛋白具有生物学活性,可促进人乳腺癌细胞的增殖,为今后制备相应抗体奠定基础并为乳腺癌的靶向治疗提供新的方法。 展开更多

关键词 GRO-ɑ 重组蛋白 CCK8 MCF-7

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CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定 被引量：1

12

作者 程海清 贾筱琴 +4 位作者 李红 李玉华 朱进 管晓虹 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1055-1059,共5页

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响。方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA... 目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响。方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定。用脂质体转染法将质粒共转染293T细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-timePCR、Western-blot检测CTGFmRNA和蛋白的表达。结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGFmRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 RNA干扰 CTGF 慢病毒 肝癌

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