表观基因组学研究方法进展与评价 被引量：15

1

作者 谭建新 孙玉洁 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期3-12,共10页

表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化,如DNA甲基化和组蛋白修饰等;表观基因组学则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容,人类表观基因组计划的最终... 表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化,如DNA甲基化和组蛋白修饰等;表观基因组学则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容,人类表观基因组计划的最终目标是绘制出人类基因组中甲基化可变位点图谱。随着研究的不断深入,各种研究方法被开发出来以满足不同类型研究的需要。文章主要介绍目前已有的表观基因组学研究方法,并对其进行简要分析和总结。 展开更多

关键词 表观遗传学 表观基因组学 DNA甲基化 研究方法

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细胞凋亡反应中NOXA基因启动子发挥增强子功能调节BCL2基因表达 被引量：1

2

作者 秦中勇 石晓 +5 位作者 曹平平 褚鹰 管蔚 杨楠 程禾 孙玉洁 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1110-1121,共12页

真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控,部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。NOXA与BCL2分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现,NOXA基因启动子与BCL2基因启动子在染色质三维空间结构上存... 真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控,部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。NOXA与BCL2分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现,NOXA基因启动子与BCL2基因启动子在染色质三维空间结构上存在相互作用,且NOXA基因启动子区兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰标记。为进一步探究NOXA启动子是否具有增强子活性、能否在细胞凋亡过程中作为增强子调控BCL2基因表达,本研究利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture,3C)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和荧光素酶报告基因等检测技术在喜树碱诱导的MCF-7细胞凋亡模型中证实,NOXA启动子兼具增强子活性,并可通过形成染色质环结构远程调控BCL2基因表达。NOXA启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关,在较弱凋亡信号刺激下(1μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子主要发挥增强子功能;随着凋亡刺激信号的加强(10μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子活性增强,主要调控其基因自身的表达,促进细胞凋亡。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)证实NOXA启动子区启动子活性和增强子活性的动态变化与其组蛋白修饰标志一致。本研究为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。 展开更多

关键词 NOXA启动子 增强子 双重调控功能 BCL2基因 细胞凋亡

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DNMT3a通过提升基因内部甲基化介导紫杉醇诱导的LINE-1异常表达 被引量：7

3

作者 王昕源 张雨 +2 位作者 杨楠 程禾 孙玉洁 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期100-111,共12页

药物诱导的长散在重复序列LINE-1异常激活可促进细胞基因组不稳定,而基因组不稳定是促进肿瘤发生发展和耐药表型形成的重要因素。因此,探索LINE-1异常激活的分子机制具有重要的理论和临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的重要方式,已知... 药物诱导的长散在重复序列LINE-1异常激活可促进细胞基因组不稳定,而基因组不稳定是促进肿瘤发生发展和耐药表型形成的重要因素。因此,探索LINE-1异常激活的分子机制具有重要的理论和临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的重要方式,已知DNA甲基转移酶家族成员DNMT3a不仅能通过促进基因启动子甲基化抑制基因表达,还可通过增强基因内部甲基化上调基因表达。本实验室前期研究发现,将乳腺癌细胞暴露于化疗药物可诱导LINE-1异常高表达,但LINE-1启动子甲基化水平并无显著改变。本研究进一步探讨了在化疗药物压力下DNMT3a是否可通过增强LINE-1基因内部甲基化水平促进LINE-1在乳腺癌细胞中的异常高表达。ChIP实验和甲基分析结果显示,用化疗药物紫杉醇(PTX)处理乳腺癌细胞,不仅可以诱导DNMT3a表达,而且可以促进DNMT3a与LINE-1基因内部区域的结合,提升其基因内部甲基化水平,进而上调LINE-1的表达水平。利用表达载体增加细胞内DNMT3a的表达水平,可显著上调LINE-1基因内部的甲基化及基因的表达水平,而下调DNMT3a的表达可有效抑制LINE-1表达。上述研究结果表明,DNMT3a介导的基因非启动子区甲基化在药物诱导的LINE-1异常激活中发挥重要作用,为认识LINE-1在乳腺癌化疗耐药性形成过程中异常激活的机制提供了新思路。 展开更多

关键词 乳腺癌 LINE-1异常激活 基因内部DNA甲基化 DNMT3a

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氟化聚乙烯亚胺衍生物构成的胶束载体的构建、表征及其在跨血-脑屏障递送中的作用研究

4

作者 郭小瑭 卢席缘 李聚学 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第8期1035-1043,共9页

目的:探讨由氟化聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)衍生物构成的纳米胶束的构建、表征及其在跨血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进行基因递送中的作用。方法:使用PEI和七氟丁酸酐(heptafluorobutyric anhydride,HFAA)通过化学反应合... 目的:探讨由氟化聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)衍生物构成的纳米胶束的构建、表征及其在跨血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进行基因递送中的作用。方法:使用PEI和七氟丁酸酐(heptafluorobutyric anhydride,HFAA)通过化学反应合成PEI-HFAA,随后通过酰胺反应连接芥子酸(sinapic acid,SA)得到产物PEI-HFAA-SA(简称SPF),最终在SPF外包裹聚山梨酯80(polysorbate 80,PS80)得到最终产物PEI-HFAA-SA@PS80(简称SPFT)。通过傅里叶变换红外吸收光谱、核磁共振氟谱和核磁共振氢谱等对SPFT的分子键和元素组成进行分析,并通过动态光散射实验、琼脂糖凝胶阻滞实验和扫描电镜观察对其水合直径、质粒吸附及保护能力、载体质粒复合体的稳定性和形貌进行进一步表征。探究SPFT在小鼠神经胶质瘤细胞Neuro 2a中的基因转染效率和细胞毒性,通过尾静脉注射携带绿色荧光蛋白表达质粒的SPFT至C57BL/6J小鼠中,观察其在脑组织中的分布情况以及BBB内细胞的基因转染效果。结果:以SA和HFAA修饰以及PS80包裹的方法合成了SFPT。检测结果显示,SPFT水动力粒径100~200 nm,并且对质粒有一定的携带和保护作用。SPFT携带质粒在体外表现出良好的转染能力和生物相容性。体内实验显示,尾静脉注射后的SPFT在小鼠大脑中有聚集现象,能够携带质粒穿越BBB并进行基因递送。结论:SPFT具有一定生物相容性和良好的穿越BBB及基因递送能力,为脑部疾病的治疗药物递送提供了新的思路。 展开更多

关键词 芥子酸 血-脑屏障 聚乙烯亚胺 氟化修饰

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鉴定定量PCR不同引物对的扩增效率 被引量：3

5

作者 张静静 马长艳 孙玉洁 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期645-648,共4页

目的:采用载体构建及荧光定量PCR的方法比较BCL2等位基因不同部位PCR引物在定量分析中的扩增效率,判断其用于不同等位基因转录活性分析的可靠性。方法:用PCR扩增包含定量PCR目的片段的序列,然后将扩增产物分别插入pGEM-TEasy载体中,构建... 目的:采用载体构建及荧光定量PCR的方法比较BCL2等位基因不同部位PCR引物在定量分析中的扩增效率,判断其用于不同等位基因转录活性分析的可靠性。方法:用PCR扩增包含定量PCR目的片段的序列,然后将扩增产物分别插入pGEM-TEasy载体中,构建TA3重组载体,再以TA3载体为模板,采用荧光定量PCR方法比较引物对之间扩增效率。结果:定量PCR结果显示引物对之间扩增效率无明显差异。结论:所检测的PCR引物对之间的扩增效率一致,可用于比较分析mbr+/mbr-Nalm-6杂合子细胞系中两个等位基因表达活性。 展开更多

关键词 PCR 引物 扩增效率

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microRNA-24通过下调Cdk4和CyclinD3抑制胰岛β细胞增殖 被引量：5

6

作者 常晓嫒 朱云霞 +1 位作者 韩晓 程光 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1413-1417,共5页

目的 :通过共同过表达Cdk4、CyclinD3与microRNA-24,观察miR-24所引起的胰岛β细胞增殖抑制是否得到逆转,从而判定Cdk4、CyclinD3是否介导了这种抑制作用。方法:在胰岛β细胞系MIN6细胞中过表达miR-24,运用WST-1法检测细胞活力,借助于... 目的 :通过共同过表达Cdk4、CyclinD3与microRNA-24,观察miR-24所引起的胰岛β细胞增殖抑制是否得到逆转,从而判定Cdk4、CyclinD3是否介导了这种抑制作用。方法:在胰岛β细胞系MIN6细胞中过表达miR-24,运用WST-1法检测细胞活力,借助于流式细胞术检测细胞周期,Hoechst33342染色和Brd U标记检测细胞增殖凋亡情况。Western blot检测Cdk4、CyclinD3蛋白水平。构建cyclinD3-p CMV5-myc,cdk4-p CMV5-myc重组质粒,与pre-miR-24、pre-Neg miRNA precursors共转染MIN6细胞,Brd U标记检测细胞增殖。结果:过表达miR-24引起MIN6细胞活力降低,细胞周期G2期阻滞,细胞增殖受到抑制而并没有显著的凋亡;过表达miR-24降低了Cdk4、CyclinD3蛋白水平;而Cdk4、CyclinD3的过表达逆转了miR-24引起的胰岛β细胞增殖抑制。结论:miR-24通过降低Cdk4、CyclinD3蛋白水平抑制胰岛β细胞增殖,该作用可被Cdk4、CyclinD3蛋白的过表达逆转。 展开更多

关键词 MICRORNA 胰岛Β细胞 增殖抑制

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3T3-L1前脂肪细胞分化过程中自噬的发生与线粒体数目的改变 被引量：1

7

作者 张许 林海燕 +2 位作者 尹业 韩晓 程光 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1675-1679,共5页

目的 :探索3T3-L1前脂肪细胞分化过程中自噬的发生与线粒体数目改变的关系。方法 :培养3T3-L1前脂肪细胞,利用电子显微镜技术观察细胞分化过程中自噬小泡的形成与变化、线粒体数目的改变,同时运用Western blot检测NRF1、mt TFA的表达。... 目的 :探索3T3-L1前脂肪细胞分化过程中自噬的发生与线粒体数目改变的关系。方法 :培养3T3-L1前脂肪细胞,利用电子显微镜技术观察细胞分化过程中自噬小泡的形成与变化、线粒体数目的改变,同时运用Western blot检测NRF1、mt TFA的表达。结果:电镜结果显示:在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,自噬小泡出现在细胞分化的第2天,随后迅速增加,第4天自噬小泡的面积达到最大,第6天开始消失;线粒体数目在分化第2天显著下降,第4天开始逐渐增加,到第6天超过分化前的水平并在第8天恢复;在分化过程中的自噬小泡内,有被吞噬的线粒体。Western blot结果则显示调控线粒体合成的转录因子NRF1、mt TFA的表达在分化第2天显著下降,第4天迅速升高,至分化末期再次下降。结论 :3T3-L1前脂肪细胞分化过程的早中期形成了大量的自噬小泡,包括一些线粒体自噬,这些线粒体自噬的发生可能是分化早期线粒体数目减少的原因之一。 展开更多

关键词 自噬 脂肪细胞分化 线粒体

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小鼠PPA1重组腺病毒的构建及在胰岛β细胞中的表达 被引量：1

8

作者 郑月 张许 韩晓 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1019-1024,共6页

目的:构建小鼠PPA1重组腺病毒,观察重组腺病毒在小鼠胰岛和β-TC6细胞中的表达,以及对脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡的影响。方法:将目的基因PPA1插入到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,质粒经PCR鉴定正确后用PmeⅠ酶切线性化,转到含有腺病... 目的:构建小鼠PPA1重组腺病毒,观察重组腺病毒在小鼠胰岛和β-TC6细胞中的表达,以及对脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡的影响。方法:将目的基因PPA1插入到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,质粒经PCR鉴定正确后用PmeⅠ酶切线性化,转到含有腺病毒骨架pAdeasy-1的BJ5183细菌中进行同源重组,重组成功的质粒经PacⅠ酶切线性化后转染QBI-293A细胞,经包装得到Ad-PPA1腺病毒。根据绿色荧光蛋白(GFP)检测病毒滴度和感染效率。用病毒感染小鼠胰岛和β-TC6细胞,以Western blot法检测PPA1蛋白表达水平。Hoechst染色法检测PPA1对细胞凋亡的影响。结果:重组腺病毒载体pAdeasyPPA1经酶切鉴定确认构建成功,将pAdeasy-PPA1转染QBI-293A细胞,观察细胞病变效应提示病毒成功包装。重组腺病毒能够有效感染小鼠胰岛和β-TC6细胞并成功过表达PPA1蛋白。Hoechst染色结果表明过表达PPA1可保护脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡。结论:成功构建携带小鼠PPA1基因的重组腺病毒,并证实过表达PPA1具有抗凋亡的作用,为进一步研究PPA1在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 PPA1 腺病毒载体 胰岛Β细胞

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乳腺癌MCF-7细胞Alu甲基化水平的MSRE-qPCR法检测 被引量：1

9

作者 徐酩 吕京澴 孙玉洁 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期951-956,共6页

目的:寻找简单、可靠、经济并适合大批量检测肿瘤组织标本和肿瘤细胞系中Alu甲基化水平的实验方法。方法:用对甲基化敏感的限制性内切酶联合定量PCR(methylation-sensitive restriction endonuclease digestion and quantitative PCR,MS... 目的:寻找简单、可靠、经济并适合大批量检测肿瘤组织标本和肿瘤细胞系中Alu甲基化水平的实验方法。方法:用对甲基化敏感的限制性内切酶联合定量PCR(methylation-sensitive restriction endonuclease digestion and quantitative PCR,MSRE-qPCR)法检测乳腺癌细胞系MCF-7中Alu序列的甲基化水平,并与常用的亚硫酸氢盐修饰结合测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)进行比较。结果:MSRE-qPCR显示Alu甲基化水平在BstUⅠ酶切位点约为33.7%,在HpaⅡ酶切位点约为56.1%,与BSP法比较,两种方法都显示BstUⅠ位点甲基化水平较低,而HpaⅡ位点甲基化水平较高,趋势一致,并提示MCF-7细胞的Alu甲基化水平明显低于正常细胞(84.6%或者更高)。结论:MSRE-qPCR法简单、可靠、经济,适合用于大批量检测Alu甲基化水平。 展开更多

关键词 MCF-7 Alu甲基化 MSRE-qPCR

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利用FRET技术检测膜受体与胞外配体相互作用的优化策略 被引量：2

10

作者 马廷政 曹平平 +1 位作者 汪徐春 孙玉洁 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1049-1054,共6页

目的:以LRP6膜受体与WNT3A相互作用为模型,针对FRET技术在研究膜受体与胞外配体相互作用中的限制因素,探究有效的改进策略。方法:利用PDB与Zdock数据库建立LRP6与WNT3A的相互作用模型,在不影响LRP6膜受体与WNT3A相互作用的前提下对LRP6... 目的:以LRP6膜受体与WNT3A相互作用为模型,针对FRET技术在研究膜受体与胞外配体相互作用中的限制因素,探究有效的改进策略。方法:利用PDB与Zdock数据库建立LRP6与WNT3A的相互作用模型,在不影响LRP6膜受体与WNT3A相互作用的前提下对LRP6进行一定的截短;将LRP6与WNT3A的信号肽重构在荧光标签的氨基末端,以避免信号肽切除导致的荧光标签丢失;使用柔性连接肽衔接信号肽、荧光标签及成熟蛋白,以削弱荧光标签对膜受体的亚细胞定位及功能的影响。结果:改进策略显著增强LRP6融合蛋白的膜定位信号,LRP6与WNT3A在细胞膜区域的相互作用能够用FRET技术进行清晰检测,平均FRET效率达到26.51%。结论:改进策略有效,为利用FRET技术研究活细胞中膜受体与胞外配体相互作用提供了新的思路和策略。 展开更多

关键词 荧光共振能量转移 蛋白质相互作用 膜受体 配体

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肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF19的研究进展 被引量：1

11

作者 马廷政 汪徐春 孙玉洁 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第1期100-106,共7页

肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF)通过与肿瘤坏死因子超家族成员相互作用调节免疫应答,调控细胞生存、增殖和分化等。TNFRSF19是TNFRSF家族的新成员之一,主要表达于上皮细胞、毛囊和大脑组... 肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF)通过与肿瘤坏死因子超家族成员相互作用调节免疫应答,调控细胞生存、增殖和分化等。TNFRSF19是TNFRSF家族的新成员之一,主要表达于上皮细胞、毛囊和大脑组织细胞中。近年来相关研究表明,TNFRSF19在调节神经系统发育和维持干细胞干性中发挥重要生理功能。TNFRSF19在不同肿瘤中发挥截然相反的促癌或抑癌功能,其功能与肿瘤的组织来源密切相关。本文就TNFRSF19的生理功能及其在癌症中的最新研究进展进行简要综述。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子受体超家族 肿瘤坏死因子超家族 TNFRSF19

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氯氮平对斑马鱼心脏发育的影响及机制研究

12

作者 黄凯玥 张伟 +2 位作者 朱玉婕 孙玉洁 袁栎 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第12期1630-1635,共6页

目的:探索氯氮平(clozapine,CLP)对斑马鱼心脏发育的损伤效应及相关机制。方法:以12.5μmol/L氯氮平(L⁃CLP)及25.0μmol/L氯氮平(H⁃CLP)处理斑马鱼胚胎72 h,显微镜下检测心脏形态、心率、静脉窦⁃动脉球(sinus venosus⁃bulbus arteriosus... 目的:探索氯氮平(clozapine,CLP)对斑马鱼心脏发育的损伤效应及相关机制。方法:以12.5μmol/L氯氮平(L⁃CLP)及25.0μmol/L氯氮平(H⁃CLP)处理斑马鱼胚胎72 h,显微镜下检测心脏形态、心率、静脉窦⁃动脉球(sinus venosus⁃bulbus arteriosus,SV⁃BA)距离等指标;实时荧光定量聚合酶链反应(RT⁃PCR)检测心脏发育相关基因NKX2.5、Hand2及Cmlc2表达;此外,H⁃CLP组处理24 h后,利用内质网抑制剂4⁃苯基丁酸(4⁃phenylbutyric acid,4⁃PBA)或多巴胺D2受体抑制剂溴隐亭(bro⁃mocriptine,BRC)联合处理48 h后,统计心脏功能指标,检测内质网应激分子(Chop、Bip)及凋亡相关分子(Caspase3、Bax/Bcl2)的表达。结果:CLP剂量依赖性导致斑马鱼心脏结构及功能损伤,Chop、Bip和Caspase3、Bax/Bcl2的表达增加;4⁃PBA及BRC显著缓解CLP诱导的心脏损伤及Chop、Bip、Caspase3、Bax/Bcl2的高表达。结论:CLP导致斑马鱼心脏发育受损,可能与抑制多巴胺D2受体、激发内质网应激有关。 展开更多

关键词 氯氮平 心脏毒性 斑马鱼胚胎 内质网应激

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