妊娠不同时期胎盘单核-巨噬细胞免疫学特性的比较 被引量：1

1

作者 何敏 张晓洁 季晓辉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1144-1150,共7页

目的:通过比较妊娠不同时期胎盘树突状细胞(dendritic cells,DCs)的前体细胞——单核-巨噬细胞的免疫学特性的差异,探索胎盘免疫细胞及微环境在妊娠耐受和分娩发动中的可能作用。方法:机械法分离中、晚期胎盘中的蜕膜组织细胞,密度梯度... 目的:通过比较妊娠不同时期胎盘树突状细胞(dendritic cells,DCs)的前体细胞——单核-巨噬细胞的免疫学特性的差异,探索胎盘免疫细胞及微环境在妊娠耐受和分娩发动中的可能作用。方法:机械法分离中、晚期胎盘中的蜕膜组织细胞,密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC),经CD14+免疫磁珠分选,获得胎盘组织的单核-巨噬细胞。流式细胞仪分析其细胞表型,ELISA检测其细胞培养上清中的细胞因子。再将分离获得的胎盘组织单核-巨噬细胞与同种异体淋巴细胞混合培养,以CCK-8法检测单核-巨噬细胞激发同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA检测混合培养上清中的细胞因子。结果:自胎盘蜕膜组织中分离获得的单核-巨噬细胞纯度达到93%左右。足月胎盘来源的单核-巨噬细胞低表达与细胞免疫激活有关的细胞表面标志物CD80、CD86、HLA-DR,不表达CD83;细胞培养上清中低表达IL-10、TGF-β;具有较弱的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,与同种异体淋巴细胞混合培养,上清中低表达IL-10,高表达TGF-β。相比之下,中期妊娠胎盘单核-巨噬细胞CD80、CD86的表达水平较高,以HLA-DR更显著(P<0.05),CD83也有微弱的表达;细胞培养上清中高表达IL-10、TGF-β(P<0.05);其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力也很弱,混合培养上清中高表达IL-10、TGF-β。结论:作为DCs的前体细胞,妊娠不同时期的单核-巨噬细胞在不同的子宫胎盘环境中已处于不同的状态。中期妊娠胎盘来源的单核-巨噬细胞可能通过IL-10发挥免疫抑制功能。 展开更多

关键词 妊娠 胎盘 单核-巨噬细胞 免疫

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系统性红斑狼疮患者淋巴细胞亚群早期凋亡的初步研究 被引量：12

2

作者 徐娟 王慧娟 +4 位作者 姚婷 王书奎 王玲 柯瑶 季晓辉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期231-234,共4页

目的:检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中不同细胞亚群发生凋亡的情况,并初步分析其在SLE发病机制中的意义。方法:取28例SLE患者和性别年龄与之相匹配的20个正常对照者。采用淋巴细胞亚群标志、An-nexin-V及碘化丙啶... 目的:检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中不同细胞亚群发生凋亡的情况,并初步分析其在SLE发病机制中的意义。方法:取28例SLE患者和性别年龄与之相匹配的20个正常对照者。采用淋巴细胞亚群标志、An-nexin-V及碘化丙啶三色荧光标记、流式细胞术检测细胞的早期凋亡。结果:SLE患者体内CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的凋亡百分率均显著高于正常对照组(P<0.05)。同时,SLE患者T淋巴细胞的死亡百分率也高于正常人。经激素治疗一定时间后,这些细胞亚群的凋亡率会进一步升高(P<0.01),但CD4/CD8比值恢复至接近正常人。SLE患者体内CD19+B淋巴细胞的凋亡或死亡百分率和正常对照组相比均无明显差别,激素治疗对B细胞凋亡和死亡的影响亦不显著。结论:在SLE患者体内主要是T淋巴细胞凋亡增加,但SLE患者淋巴细胞数目减少不仅仅是因为细胞凋亡所致,死亡细胞数目明显升高也是其中一个重要原因。激素治疗可诱导SLE患者T淋巴细胞进一步发生凋亡,并使T细胞亚群比例有所改善。 展开更多

关键词 红斑狼疮 系统性 细胞凋亡 三色荧光标记 流式细胞术

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系统性红斑狼疮患者外周血CD_4^+CD_(25)^+ T细胞亚群的初步研究 被引量：10

3

作者 张春兵 杨晓帆 +4 位作者 王慧娟 张明顺 苏定雷 柯瑶 季晓辉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期455-458,共4页

目的研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中CD4+CD25+T细胞亚群的比率改变。方法采用微量全血三色标记法,以流式细胞技术检测SLE患者外周血CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD45RO+T细胞亚群,分析阳性细胞百分率和平均荧光强度(Meanfluorescen... 目的研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中CD4+CD25+T细胞亚群的比率改变。方法采用微量全血三色标记法,以流式细胞技术检测SLE患者外周血CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD45RO+T细胞亚群,分析阳性细胞百分率和平均荧光强度(Meanfluorescenceintensity,MFI)。结果SLE患者外周血中CD4+T细胞百分率,活动期(29.29%±8.86)%和非活动期(29.55±8.96)%均低于正常对照(37.41±3.29)%(P均<0.05);CD4+CD25+T细胞百分率SLE活动期(10.30±5.60)%显著高于正常对照(5.39±1.43)%(P<0.05),非活动性SLE病人组(5.63±2.49)%和正常组差异无显著性(P>0.05);CD4+CD25+CD45RO+T细胞百分率SLE活动期(3.96±3.51)%显著高于正常对照(1.39±0.63)%,非活动期(0.75±0.66)%显著低于正常对照(P均<0.05)。平均荧光强度分析表明SLE患者组和正常组的CD25和CD45RO抗原密度差异并无显著性(P均>0.05)。结论SLE患者外周血中存在CD4+CD25+及CD4+CD25+CD45RO+T细胞亚群比率异常增高,且与病情活动性相关。 展开更多

关键词 红斑狼疮 系统性 外周血细胞 CD4^+CD25^+T细胞

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系统性红斑狼疮患者血清抗亲环素A抗体检测的临床意义 被引量：7

4

作者 张缪佳 刘晓华 +5 位作者 陈子庆 沈友轩 顾镭 柯瑶 王艳艳 季晓辉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期446-449,共4页

目的:观察血清抗亲环素(CyP)A抗体对系统性红斑狼疮(SLE)的诊断价值与临床意义。方法:用ELISA方法检测54例SLE、36例其他自身免疫病患者及40例健康对照者血清IgG、3种抗CyP A抗体并结合活动性评分、系统损害进行分析。结果:54例SLE患者... 目的:观察血清抗亲环素(CyP)A抗体对系统性红斑狼疮(SLE)的诊断价值与临床意义。方法:用ELISA方法检测54例SLE、36例其他自身免疫病患者及40例健康对照者血清IgG、3种抗CyP A抗体并结合活动性评分、系统损害进行分析。结果:54例SLE患者中23例检出IgG型抗CyP A抗体,15例IgM型、3例IgA型抗CyP A抗体。IgG型抗CyP A抗体的灵敏度为42.6％,特异性为55.6％,IgM型CyP抗体的灵敏度为27.8％,特异性为36.1％。SLE重度活动组两型抗CyP A抗体检出率高于稳定期及轻、中度活动组。IgG型及IgM型抗体与血中低补体及免疫球蛋白升高有关,IgG型抗CyP A抗体与SLE关节肌肉症状及白细胞减少有关。结论:IgG型抗CyP A抗体检出的临床价值优于IgM型抗体。CyP A抗体非SLE特异性抗体,但可作为判断SLE病情活动性的参考指标之一。 展开更多

关键词 抗亲环素A抗体 系统性红斑狼疮 自身免疫病 诊断价值

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系统性红斑狼疮26例IL-10及IL-12的异常表达及其相互作用 被引量：4

5

作者 邢美芬 刘晓华 +3 位作者 姜玉章 王慧娟 杨晓帆 季晓辉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期283-287,共5页

目的:了解系统性红斑狼疮(SLE)患者白细胞介素(IL)-10、IL-12异常表达的相互关系,探讨IL-10对IL-12分泌的影响。方法:取26例SLE患者及正常对照18例志愿者的外周血(PBMCs),用ELISA法测定其血清、单个核细胞(PBMCs)培养上清、植物血凝素(P... 目的:了解系统性红斑狼疮(SLE)患者白细胞介素(IL)-10、IL-12异常表达的相互关系,探讨IL-10对IL-12分泌的影响。方法:取26例SLE患者及正常对照18例志愿者的外周血(PBMCs),用ELISA法测定其血清、单个核细胞(PBMCs)培养上清、植物血凝素(PHA)刺激培养上清中IL-10、IL-12水平;在SLE患者及正常对照PBMCs中分别加入正常人血清、SLE血清、SLE血清+IL-10抗体,PHA刺激培养24h,用ELISA法测培养上清中IL-12的水平。结果:SLE患者血清、PBMCs培养上清中自发产生和PHA刺激诱生的IL-10及IL-12P40水平均异常增高。然而仅血清IL-10水平与SLEDAI呈正相关,但血清IL-12P40水平、PBMCs培养上清自发产生的及PHA刺激诱生的IL-12P40水平均与SLEDAI呈正相关。尽管SLE患者血清IL-10水平与IL-12P40血清及PBMCs培养上清水平呈正相关,但体外实验时,在PBMCs培养中,加入SLE血清,可显著抑制IL-12的产生,采用IL-10抗体中和掉SLE血清中的IL-10后,正常人或SLE患者的PBMCs培养上清中IL-12可明显增多。结论:SLE患者IL-10及IL-12表达水平异常增高,且血清水平与SLE活动性正相关;体外细胞培养实验中SLE血清中IL-10可明显抑制IL-12的分泌,但在细胞因子网络环境中两者之间相互作用更为复杂。 展开更多

关键词 系统性红斑狼疮 白细胞介素-12 白细胞介素-10

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HIV-1Rev基因编码蛋白在PEL细胞系中的表达及其表达蛋白抑制HHV-8溶解性周期复制 被引量：3

6

作者 李久明 华立新 +4 位作者 冯宁翰 曹戌 吕志刚 秦娣 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期702-706,共5页

目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression,Rev)编码基因的重组真核表达质粒并初步探索Rev基因编码蛋白对人类疱疹病毒8型(HHV-8)溶解性周期复制的影响。方法:构建pRev-F... 目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression,Rev)编码基因的重组真核表达质粒并初步探索Rev基因编码蛋白对人类疱疹病毒8型(HHV-8)溶解性周期复制的影响。方法:构建pRev-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pRev-Flag重组质粒瞬时转染原发性渗出性淋巴瘤细胞系(PEL)BCBL-1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,采用RT-PCR、Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Rev基因的表达情况;提取瞬时转染pRev-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测HHV-8次要衣壳蛋白编码基因ORF26 mRNA转录水平。结果:核酸序列分析结果表明,克隆的Rev基因序列与GenBank中已登记的Rev序列100%同源,RT-PCR和Western blot都在Rev预期位置检测到特异性条带。RT-PCR检测显示,Rev基因编码蛋白能够降低HHV-8 ORF26 mRNA转录水平。结论:成功构建含Rev基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达;初步探索表明Rev蛋白能够抑制HHV-8溶解性周期复制。 展开更多

关键词 人类免疫缺陷病毒1型 病毒颗粒蛋白表达调节因子 人类疱疹病毒8型 复制

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人类免疫缺陷病毒1型病毒复制负调控因子编码基因的克隆及在BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中的表达 被引量：3

7

作者 曹戌 华立新 +4 位作者 冯宁翰 李久明 吕志刚 秦娣 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期434-438,444,共6页

目的:分离克隆人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的病毒复制负调控因子(Negative factor,Nef)基因,并将其导入BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的Nef基因核苷酸序列设计PCR引物,在其5′端分别引入EcoRⅠ和SalⅠ... 目的:分离克隆人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的病毒复制负调控因子(Negative factor,Nef)基因,并将其导入BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的Nef基因核苷酸序列设计PCR引物,在其5′端分别引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点;以含有Nef基因的pCINL质粒为模板,扩增Nef基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pCI-neo中。为了便于蛋白检测,在下游引物5′端引入Flag序列,构建重组真核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后分别瞬时转染BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞,用RT-PCR、Western blot分别从核酸和蛋白水平检测Nef基因的表达情况。结果:成功构建了含Nef基因的重组真核表达质粒,核酸序列分析显示,克隆的Nef基因序列全长651bp,与GenBank中登记的Nef基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Western blot都在Nef预期位置检测到特异性条带。结论:HIV-1Nef基因在BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中获得了正确表达。 展开更多

关键词 人类免疫缺陷病毒1型 病毒复制负调控因子 真核表达

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重组慢病毒载体介导HIV-1 Nef蛋白对原发性渗出性淋巴瘤细胞系和血管内皮细胞增殖作用影响的初探 被引量：1

8

作者 朱小飞 秦娣 +2 位作者 周峰 卫冰冰 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期131-137,共7页

目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含... 目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含Nef基因的重组真核表达质粒pCI-neo-Nef中扩增出Nef基因,插入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green中构建成pHAGE-Nef,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达并收集培养上清,此上清经0.45μm滤器过滤后即获得慢病毒悬液。梯度稀释法测定慢病毒滴度。将重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,用Western blot检测Nef蛋白的表达。通过细胞增殖实验检测Nef蛋白对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建了含HIV-1 Nef基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为1×107 TU/ml。以重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,均能检测到Nef蛋白的表达,且Nef蛋白能够抑制BCBL-1和EA.hy926细胞的增殖作用。结论:成功构建了含HIV-1 Nef基因的慢病毒表达载体,获得的慢病毒不仅能够有效感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,而且能够介导Nef蛋白在这些细胞中表达。重组慢病毒载体介导的Nef蛋白能够抑制BCBL-1和EA.hy926细胞的增殖。 展开更多

关键词 慢病毒 NEF 卡波济肉瘤 卡波济肉瘤相关疱诊病毒

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人类免疫缺陷病毒-1 Rev蛋白调控卡波济肉瘤相关疱疹病毒的裂解性周期复制与潜伏感染 被引量：1

9

作者 黄敏 李久明 +1 位作者 王平 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期746-751,共6页

目的:研究人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Rev蛋白的表达水平对原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解性周期复制与潜伏的影响。方法:自表达质粒pCI-neo-Rev中扩增出Rev基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中... 目的:研究人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Rev蛋白的表达水平对原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解性周期复制与潜伏的影响。方法:自表达质粒pCI-neo-Rev中扩增出Rev基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中构建成慢病毒载体pLenti-Rev,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(IZsGreen)表达;收集培养上清经0.45μm滤器过滤后即获得病毒悬液。梯度稀释法测定病毒滴度并感染细胞,RT-PCR和Western blot检测Rev在293T细胞中的表达。用慢病毒感染BCBL-1细胞,同时将表达质粒pCI-neo-Rev转染该细胞,采用Western blot分别检测Rev以及KSHV Rta和vIL-6蛋白的表达;Real-timePCR进一步从mRNA水平上定量验证Rev对KSHV复制的影响。结果:限制性内切酶酶切反应和基因测序证实成功构建了携带Rev基因的慢病毒表达载体,病毒滴度为2×107TU/ml。重组慢病毒感染BCBL-1细胞72h后,能够检测到Rev蛋白的表达。Western blot结果显示,低水平表达的Rev能够上调KSHV裂解期蛋白Rta、vIL-6的表达,而高水平表达的Rev则能够抑制Rta和vIL-6的表达。Real-time PCR进一步验证了该结果,表明高水平表达的Rev能够显著抑制BCBL-1中Rta的mRNA转录,96h尤为明显。结论:成功构建了含Rev基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达Rev蛋白。Rev蛋白的表达水平对KSHV的复制与潜伏可能起到复杂的调控作用。 展开更多

关键词 慢病毒 REV KSHV 复制

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沉默血小板反应蛋白-1基因对亚溶解型C5b-9诱导肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的影响

10

作者 邱文 李妍 +2 位作者 周建博 赵聃 王迎伟 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期29-34,47,共7页

目的研究沉默血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)基因对于亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的影响。方法设计合成针对TSP-1基因4... 目的研究沉默血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)基因对于亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的影响。方法设计合成针对TSP-1基因4个靶点的小发夹RNA(small hair RNA,shRNA),并构建相应的表达质粒,筛选沉默效率最佳的TSP-1shRNA(shTSP-1)后,将shTSP-1转染体外培养的大鼠GMC,再给予sublytic C5b-9刺激。以Westernblot检查TSP-1、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)的表达情况。另用ELISA法测定培养上清中总转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和活化TGF-β1的含量。结果核酸序列分析证明,4种TSP-1shRNA重组质粒均构建成功。Western blot实验证实,构建的shTSP-1-3(Thbs1-3)具有最佳的沉默效率。将shTSP-1-3转染大鼠GMC后,在沉默TSP-1基因表达的同时,能明显抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1活化及细胞外基质(FN和collagenⅣ)的合成。结论 TSP-1基因表达在sublytic C5b-9刺激大鼠GMC诱导TGF-β1活化及ECM分泌的过程中,发挥了重要的促进作用。 展开更多

关键词 肾小球系膜细胞 亚溶解型C5b-9复合物 血小板反应蛋白-1 细胞外基质 小发夹RNA

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HHV-8 K13基因编码蛋白在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖影响的初探

11

作者 糜远源 华立新 +6 位作者 冯宁翰 闵治超 周峰 朱小飞 王子盾 程伟 卢春 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期21-25,共5页

目的:研究人类疱疹病毒8型(HHV-8)K13(v-FLIP)基因编码蛋白分别在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达及其对上述两种细胞增殖能力的影响。方法:将PEF-K13-Flag-IRES/Puro重组质粒瞬时转染人血管内皮细胞系EA.HY926细胞和前列腺癌细胞... 目的:研究人类疱疹病毒8型(HHV-8)K13(v-FLIP)基因编码蛋白分别在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达及其对上述两种细胞增殖能力的影响。方法:将PEF-K13-Flag-IRES/Puro重组质粒瞬时转染人血管内皮细胞系EA.HY926细胞和前列腺癌细胞系PC-3细胞,采用Western blot方法检测K13基因编码蛋白表达情况;分别运用流式细胞术和MTT方法检测K13基因编码蛋白对这两种细胞增殖的影响。结果:HHV-8 K13基因编码蛋白能够在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中表达,流式细胞分析和MTT结果显示,HHV-8 K13基因编码蛋白对上述两种细胞的增殖均有明显的抑制作用(P<0.05)。结论:HHV-8 K13基因编码蛋白可以明显抑制人血管内皮细胞和前列腺癌细胞的增殖。 展开更多

关键词 前列腺癌 人类疱疹病毒8型 K13 PC-3 内皮细胞

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HIV-1假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究 被引量：1

12

作者 朱晓蕾 卢春 +1 位作者 吕志刚 秦娣 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期565-569,共5页

目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1细胞的感染状况。... 目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1细胞的感染状况。方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pVSV-GP。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的HIV-1基因组重组质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK293T细胞,收获细胞进行Western blot,检测HIV-1p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中HIV-1p24蛋白的含量。结果:PCR分离、克隆的VSV-GP序列全长1536bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在HIV-1p24蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞后上清可以检测到HIV-1p24蛋白,并且测得Luciferase活性值较对照组显著增高(P<0.05)。结论:成功包装了HIV-1假病毒,并且该病毒可以感染BCBL-1细胞。 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒包膜糖蛋白 人类免疫缺陷病毒1型假病毒 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 感染

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MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的实验研究 被引量：11

13

作者 周秀娟 黄峻 +2 位作者 姚堃 周锋 马春玲 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期238-241,F0002,共5页

目的:探讨MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的可能性。方法:将MyoD基因重组腺病毒载体转染大鼠心脏成纤维细胞,观察转染后大鼠心脏成纤维细胞形态的变化;用RT-PCR和Westernblot方法检测MyoD和肌细胞生成素的表达;免疫组化... 目的:探讨MyoD基因诱导大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞的可能性。方法:将MyoD基因重组腺病毒载体转染大鼠心脏成纤维细胞,观察转染后大鼠心脏成纤维细胞形态的变化;用RT-PCR和Westernblot方法检测MyoD和肌细胞生成素的表达;免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白的表达。结果:MyoD基因转染后的大鼠心脏成纤维细胞形态和排列方式发生明显变化;RT-PCR可检测出转染后细胞表达MyoD;Westernblot结果表明转染后细胞表达MyoD和肌细胞生成素;免疫组化检测骨骼肌肌球蛋白和结蛋白表达均为阳性。结论:MyoD基因可诱导体外培养的大鼠心脏成纤维细胞分化为成肌细胞,为进一步研究MyoD对心肌损伤的修复作用奠定了基础。 展开更多

关键词 心脏成纤维细胞 成肌细胞 MyoD基因 诱导

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妊娠不同时期胎盘单核-巨噬细胞来源的树突样细胞刺激T细胞作用的比较 被引量：11

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作者 张晓洁 季晓辉 +1 位作者 何敏 陈赛英 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期1208-1214,共7页

目的:观察不同妊娠阶段胎盘源性树突样细胞刺激T细胞活化增殖特点的差异,为分析胎盘免疫细胞在妊娠耐受和分娩发动中的可能作用提供线索。方法:机械分离中、晚期胎盘中的单核-巨噬细胞,以内皮逆穿越系统诱导其分化为树突状细胞(DC)。将... 目的:观察不同妊娠阶段胎盘源性树突样细胞刺激T细胞活化增殖特点的差异,为分析胎盘免疫细胞在妊娠耐受和分娩发动中的可能作用提供线索。方法:机械分离中、晚期胎盘中的单核-巨噬细胞,以内皮逆穿越系统诱导其分化为树突状细胞(DC)。将不同妊娠阶段胎盘单核-巨噬细胞来源的DC样细胞与同种异体T细胞共育,以CCK-8法检测其激发同种异体T细胞增殖能力及其刺激同种异体T细胞所产生的胞内细胞因子,并用流式细胞仪分析DC样细胞表型。结果:足月胎盘来源的单核-巨噬细胞经过内皮单层正逆双向穿越诱导培养后,细胞出现树突状形态改变,并高表达与树突状细胞免疫激活有关的细胞表面标志物CD80、CD86、HLA-DR。足月妊娠胎盘单核-巨噬细胞来源DC样细胞具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,同种异体淋巴细胞活化时细胞内IFN-γ+亚型的表达十分明显,但几乎不出现IL-10+亚型。但相比之下,中期妊娠胎盘单核-巨噬细胞来源的DC样细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力却很弱(P<0.05),被刺激的同种异体T细胞中CD8-(即CD4+)亚群IFN-γ+细胞显著减少(P<0.05),而CD8-和CD8+亚群中IL-10+细胞亚群却显著增多。对细胞的表型分析结果显示,中期妊娠胎盘单核-巨噬细胞来源的DC样细胞CD80、CD86及HLA-DR的表达均显著低下(P<0.05)。结论:不同妊娠时期胎盘单核-巨噬细胞分化形成具有免疫激活作用的树突状细胞的能力不同,提示其生物学特性有所不同,其可能与妊娠耐受和分娩发动有关。 展开更多

关键词 妊娠 胎盘 单核-巨噬细胞 树突状细胞 免疫

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卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究 被引量：6

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作者 陈秀英 卢春 +3 位作者 程林 曾怡 姚水洪 秦娣 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期881-886,共6页

目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系B... 目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1(+)。进一步在原有的下游引物5′端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒。将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆。最后用抗flagM2单克隆抗体进行Westernblot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达。结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHVvIL-6基因呈现100%同源性。Westernblot结果显示,在约25ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致。结论:KSHVvIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达。 展开更多

关键词 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 病毒编码IL-6 flag序列 真核表达

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正常人外周血中CD8^+CD25^+T细胞亚群的数量及其细胞因子表达的初步研究 被引量：4

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作者 王卫文 张戎 +4 位作者 杨晓帆 夏永祥 李有武 王慧娟 季晓辉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1092-1097,共6页

目的:研究正常人外周血CD8+CD25+T细胞亚群的数量及其表达IFN-γ、IL-10和TGF-β的细胞数量情况,以期得到一组该亚群细胞正常数值范围,为研究CD8+CD25+T细胞亚群在自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植中的变化及其临床意义提供参考。... 目的:研究正常人外周血CD8+CD25+T细胞亚群的数量及其表达IFN-γ、IL-10和TGF-β的细胞数量情况,以期得到一组该亚群细胞正常数值范围,为研究CD8+CD25+T细胞亚群在自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植中的变化及其临床意义提供参考。方法:分离正常人外周血单个核细胞,利用三色流式细胞术分别检测CD3+T细胞中CD8+CD25+、CD8+CD25-、CD8-CD25+和CD8-CD25-亚群的比例,并计算其细胞数量;并对经过或未经过离子霉素(ionomycin)、佛波醇乙酯(PMA)联合刺激5h的CD8+CD25+T细胞检测表达IFN-γ、IL-10及TGF-β的细胞数量情况。结果:正常人外周血CD3+T细胞中CD8+CD25+细胞亚群约为2.52%,数量达37.09×106/L,经离子霉素、佛波醇乙酯联合刺激培养5h后其比例、数量均略有降低;CD8+CD25+T细胞表面TGF-β阳性率达到93.8%,刺激对其表达无明显影响;但刺激后IFN-γ+T细胞明显增多,而IL-10+的T细胞未见明显升高。结论:正常人外周血CD3+T细胞中存在少量的CD8+CD25+细胞亚群,该细胞表面稳定地高表达TGF-β,可对刺激呈现IFN-γ反应,但不对刺激产生增殖反应。 展开更多

关键词 调节性T细胞 CD8^+CD25^+细胞亚群 TGF-β IL-10 IFN-Γ

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人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：4

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作者 张玲 卢春 +3 位作者 曾怡 钱超 唐桂霞 秦娣 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期685-688,F0002,共5页

目的:制备人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8.1的单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导含重组质粒pGEX-6p-1+K8.1的大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-S-转移酶GST/K8.1融合蛋白,将以包涵体形式存在... 目的:制备人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8.1的单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导含重组质粒pGEX-6p-1+K8.1的大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-S-转移酶GST/K8.1融合蛋白,将以包涵体形式存在的融合蛋白进行变性、复性、复性后的GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化。以纯化的GST/K8.1融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选分泌K8.1单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化染色(IHC)和Westernblot法鉴定单抗的特异性。结果:建立了一株稳定分泌抗K8.1单抗的杂交瘤细胞株,命名为3G10;IHC和Westernblot法显示,3G10株单抗能特异地识别HHV-8K8.1蛋白。结论:成功制备出抗HHV-8包膜糖蛋白K8.1的单克隆抗体。 展开更多

关键词 人类疱疹病毒8型 包膜糖蛋门K8.1 包涵体 单克隆抗体

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抗SARS冠状病毒M蛋白片段单克隆抗体的制备与初步鉴定 被引量：6

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作者 钱超 姜平 +1 位作者 卢春 姚堃 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期213-215,共3页

目的： 制备抗SARS冠状病毒（SARS-CoV） M 蛋白N端1～43氨基酸（aa）单克隆抗体（mAb）, 并对其特性进行初步鉴定.方法： 用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb.用间接ELISA法筛选能分泌... 目的： 制备抗SARS冠状病毒（SARS-CoV） M 蛋白N端1～43氨基酸（aa）单克隆抗体（mAb）, 并对其特性进行初步鉴定.方法： 用纯化的SARS-M/GST融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗M蛋白片段的mAb.用间接ELISA法筛选能分泌抗M蛋白片段mAb的杂交瘤细胞株. Western blot和间接ELISA鉴定所获mAb的特异性, 并用小鼠mAb亚类测定试剂盒检测所获的mAb Ig亚类.为分析mAb识别位点, 进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达, 以Western blot初步定位mAb识别位点.结果： 获得1株可分泌特异性抗SARS-CoV M蛋白片段的mAb杂交瘤细胞株（3H9）, Ig亚类鉴定为IgG2a, 轻链为κ型.Western blot显示其mAb可特异识别SARS-CoV M蛋白N端1～43aa, 间接ELISA证实mAb可与包被于聚苯乙烯微孔板上的SARS病毒全蛋白抗原发生特异性反应, 其识别位点位于M蛋白N端16～28aa.结论： 成功获得1株抗SARS-CoV M蛋白N端1～43aa mAb杂交瘤细胞, 并初步定位其识别位点. 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 单克隆抗体 M蛋白

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CD4^+CD25^+Foxp3^+:与SLE疾病相关的Treg标志 被引量：4

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作者 徐安琪 杨晓帆 +2 位作者 王慧娟 张缪佳 季晓辉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期745-753,共9页

目的:研究与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)病理活动相关的调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)标志。方法:分离正常人和SLE患者外周血单个核细胞(PBMCs),用三色流式细胞术(flowcytometer,FCM)检测CD4和CD8 T细胞... 目的:研究与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)病理活动相关的调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)标志。方法:分离正常人和SLE患者外周血单个核细胞(PBMCs),用三色流式细胞术(flowcytometer,FCM)检测CD4和CD8 T细胞亚群的CD25、Foxp3表达,分析T细胞Foxp3+/CD4+T、CD25+Foxp3+/CD4+、Foxp3+/CD4+CD25+、Foxp3+/CD8+、CD25+Foxp3+/CD8+、及Foxp3+/CD8+CD25+的比值变化,及其与SLE疾病活动指数(SLE disease activity index,SLEDAI)、抗-dsDNA阳性、补体C3/C4水平降低、血清IgG水平增高、肾脏损害、关节病变、白细胞减少、疾病初/复发的关系。结果:①与正常人相比,SLE患者T细胞CD4+CD25+/CD4+比值无明显改变,但中/重度SLE患者外周血T细胞Foxp3+/CD4+、CD25+Foxp3+/CD4+、及Foxp3+/CD4+CD25+比值均显著下降,并与SLEDAI呈负相关;其中CD25+Foxp3+/CD4+比值还与SLE的抗-dsDNA阳性、补体C3/C4水平降低、血清IgG水平增高相关,在疾病初发、肾脏损害、白细胞减少患者该比值下降更为显著;②SLE患者CD8+T细胞中CD25+、Foxp3+亚群比例未见明显减少,仅中/重度活动性SLE患者Foxp3+/CD8+CD25+比例减少,但与SLEDAI无相关性。结论:以CD25+Foxp3+作为Treg标志,可以明显反映出SLE患者CD4+Treg存在数量缺陷,并与疾病活动性、免疫功能紊乱和病理损害密切相关,故将CD4+CD25+Foxp3+作为标志进行Treg检测对辨明SLE患者免疫系统功能状态具有一定的临床参考价值。 展开更多

关键词 红斑狼疮 系统性 调节性T细胞 FOXP3

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人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达 被引量：4

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作者 程林 卢春 +3 位作者 陈秀英 曾怡 姚水洪 秦娣 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1145-1149,共5页

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和Bam... 目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1(+)中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。 展开更多

关键词 人类疱疹病毒8型 K9 病毒干扰素调节因子 真核表达

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