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斜纹夜蛾酵母双杂交文库的构建及其在蜕皮激素受体互作蛋白筛选中的应用 被引量:1
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作者 范琳芳 何文婧 +4 位作者 苏智仁 朱家明 罗威 张纯 黄立华 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期801-811,共11页
【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)〕结合,启... 【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)〕结合,启动20E诱导的级联反应。本研究旨在从互作蛋白角度探究EcR/USP自身调控的分子机理。【方法】以重要农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,通过构建酵母双杂交筛选系统分别筛选了与EcR和USP相互作用的蛋白。【结果】文库转化效率达到3.0×106cfu/μg,文库滴度达到1.3×108cfu/m L,文库插入片段大小在500~2 000 bp之间。4种诱饵质粒(EcRA/p GBKT7,EcRB1/p GBKT7,USP1/p GBKT7和USP2/p GBKT7)对酵母细胞无毒性,并且无自激活性,说明构建的酵母双杂交文库质量可靠。用以上4种诱饵质粒筛选酵母双杂交文库,共得到110个互作蛋白,其中与EcRB1,USP1和USP2互作的蛋白分别有26,52和32个,未筛选到与EcRA互作的蛋白。随后,从中挑选了Dna J-5(Hsp40 homolog 5,一种热激蛋白分子伴侣),MBF2(mediator of Bm FTZ-F1 type 2,一种转录共激活子),polyubiquitin(多聚泛素类蛋白),esr16(ecdysteroid regulated 16k Da protein,一种蜕皮激素调控蛋白)和NEDD8-like(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated protein 8,一种泛素调节相关蛋白)5种蛋白,利用酵母双杂交和Far-Western印迹法进一步验证了蛋白间的互作关系。【结论】分子伴侣和泛素化修饰等在蜕皮激素受体调控中可能起着重要作用。本研究对深入理解昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。 展开更多
关键词 斜纹夜蛾 变态发育 蜕皮激素受体 酵母双杂交文库 互作蛋白
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家蚕Bmlark基因启动子活性及转录调控元件分析
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作者 吴桐 牛康康 +1 位作者 彭玉玲 冯启理 《环境昆虫学报》 CSCD 北大核心 2022年第3期704-712,共9页
LARK蛋白是一个参与多个发育途径的重要调控转录因子。为研究家蚕Bmlark基因启动子活性及其调控蛋白,本研究克隆了家蚕Bmlark基因的启动子序列(-1232~+211),构建了该启动子萤光素酶报告质粒,转染至家蚕Bm12细胞中,进行启动子萤光素酶活... LARK蛋白是一个参与多个发育途径的重要调控转录因子。为研究家蚕Bmlark基因启动子活性及其调控蛋白,本研究克隆了家蚕Bmlark基因的启动子序列(-1232~+211),构建了该启动子萤光素酶报告质粒,转染至家蚕Bm12细胞中,进行启动子萤光素酶活性检测。结果表明,Bmlark基因的-124~-92 bp和-220~-124 bp区域参与了其转录调控。利用-124~-92 bp区域的DNA片段作为分子探针,发现该区域可能与蛋白TAF7,Ets transcription factor,protein abrupt isoform X1和forkhead box protein N3等结合。研究结果为进一步深入研究Bmlark转录调控的分子机制提供了线索。 展开更多
关键词 Bmlark基因 启动子 双萤光素酶报告系统 结合蛋白
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细胞自噬介导的动物脂代谢及其检测 被引量:1
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作者 田铃 郭三友 +2 位作者 吴文梅 王玉洁 李康 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期347-356,共10页
细胞自噬(autophagy)是从酵母到哺乳动物都高度保守的、降解胞内物质的过程,受到能量和营养等信号的严格调控。已有研究表明,哺乳动物中高脂饮食可诱导肝脏内自噬的发生,某些自噬相关基因(autophagy related genes,Atg)敲除后阻碍肝脏... 细胞自噬(autophagy)是从酵母到哺乳动物都高度保守的、降解胞内物质的过程,受到能量和营养等信号的严格调控。已有研究表明,哺乳动物中高脂饮食可诱导肝脏内自噬的发生,某些自噬相关基因(autophagy related genes,Atg)敲除后阻碍肝脏细胞的脂代谢,并导致脂滴堆积,形成脂肪肝。昆虫中的现有研究也暗示细胞自噬与昆虫脂肪体的代谢密切相关。目前为止,细胞自噬调控脂代谢的研究还有许多不明之处。除已报道的ATG蛋白外是否其他ATG蛋白也参与脂代谢尚无报道;已知的参与脂代谢的ATG蛋白分子作用模式不清楚;溶酶体中哪些酶参与了自噬介导的脂代谢也未被证实。ATG蛋白差异参与真菌和高等动物的脂滴形成与脂肪降解,但具体机制不详,昆虫的进化地位介于高等动物和真菌之间,昆虫中开展自噬介导脂代谢的研究对于解析高等动物的疾病诸如肥胖症、高血脂症,及以昆虫脂肪体代谢发育为调控靶标的工作具有重要意义。为此,本文对主要在哺乳动物中获得的自噬介导脂代谢的研究进展进行综述,并对脂代谢的一些研究方法和检测技术进行了总结,以期为昆虫乃至其他生物的相关研究提供借鉴与参考。 展开更多
关键词 细胞自噬 自噬体 自噬相关蛋白 脂肪体 脂代谢
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家蚕表皮型几丁质合成酶基因BmCHSA-2a的鉴定及其对激素的响应 被引量:3
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作者 张捷 丁洋 郑思春 《华南师范大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2018年第1期65-71,共7页
文中采用5'Race方法获得了家蚕几丁质合成酶基因(BmCHSA-2a)的第1外显子(Exon 1,141 bp)和第2外显子(Exon 2a,106 bp),证明外显子2a在鳞翅目昆虫几丁质合成酶中高度保守.根据该外显子序列设计引物,分析BmCHSA-2a对激素的响应,结果表... 文中采用5'Race方法获得了家蚕几丁质合成酶基因(BmCHSA-2a)的第1外显子(Exon 1,141 bp)和第2外显子(Exon 2a,106 bp),证明外显子2a在鳞翅目昆虫几丁质合成酶中高度保守.根据该外显子序列设计引物,分析BmCHSA-2a对激素的响应,结果表明:蜕皮激素(Ecdysone,20E)抑制BmCHSA-2a的表达;保幼激素(Juvenile Hormone,JH)间接促进其表达.根据家蚕基因组所预测的启动子序列,扩增了调控BmCHSA-2a表达的启动子,证明蜕皮激素抑制启动子活性,并存在大量蜕皮激素通路BmFTZ-F1的调控元件.对BmFTZ-F1表达调控的进一步研究表明:蜕皮激素抑制其表达.研究结果初步分析了家蚕表皮几丁质合成酶基因BmCHSA-2a可能的表达机制,为深入研究其表达调控机理及发现害虫防治新靶标提供了理论基础. 展开更多
关键词 家蚕 表皮几丁质合成酶 可变剪切 激素 表达
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家蚕翅原基表皮蛋白基因BmWCPs的生物信息学分析与激素诱导表达特征 被引量:1
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作者 朱子丹 章佳玲 +1 位作者 冯启理 邓惠敏 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期805-813,共9页
翅原基表皮蛋白(WCPs)在昆虫翅的发育中起着非常重要的作用。为了研究家蚕翅原基表皮蛋白基因BmW CPs的表达是否与蜕皮激素(20E)的调节有关,用生物信息学方法分析BmW CPs基因的序列结构与系统进化特点,并通过半定量RT-PCR检测蜕皮... 翅原基表皮蛋白(WCPs)在昆虫翅的发育中起着非常重要的作用。为了研究家蚕翅原基表皮蛋白基因BmW CPs的表达是否与蜕皮激素(20E)的调节有关,用生物信息学方法分析BmW CPs基因的序列结构与系统进化特点,并通过半定量RT-PCR检测蜕皮激素对部分BmW CPs基因表达的诱导作用。11个BmW CPs基因成簇分布在家蚕基因组中,除BmW CP6和BmW CP10分别分布在第7号、第21号染色体外,其余的BmW CPs均分布在第22号染色体上;11个BmW CPs的核苷酸序列长度为588~2 670 bp,编码115~312个氨基酸,蛋白质分子质量12~35 kD,等电点4.30~7.45;11个BmW CPs基因的ORF内均有内含子插入,81.82%的基因含有2~3个内含子,内含子长度50~5 958 bp,在50~300 bp之间分布频率最高,占46%。将解剖获取的上蔟1 d蚕体的翅原基进行体外培养,并用浓度为2μmol/L的20E直接处理12 h后再常规培养18 h,提取翅原基总RNA并反转录合成cD NA,经半定量RT-PCR检测样品中BmW CPs的表达水平显著上调。依据上述研究结果初步认为,用蜕皮激素直接处理12 h后再常规培养18 h的脉冲作用,可诱导基因组中成簇分布的BmW CPs在翅原基组织中大量表达,以利于家蚕完成翅原基的变态发育。 展开更多
关键词 家蚕 翅原基表皮蛋白基因 序列特征 诱导表达 蜕皮激素
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家蚕保幼激素信号途径中转录因子BmKr-h1的基因克隆与表达分析 被引量:1
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作者 胡启豪 朱子丹 +2 位作者 李婵丹 冯启理 邓惠敏 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期415-424,共10页
Krüppel homolog 1(Kr-h1)是含有C2H2锌指结构的转录因子,在昆虫变态发育中起重要作用。从家蚕5龄第3天幼虫的表皮中克隆了Bm Kr-h1基因,该基因全长c DNA为1 918 bp,其中开放阅读框1 047 bp,GC含量42.2%,编码348个氨基酸。氨基酸... Krüppel homolog 1(Kr-h1)是含有C2H2锌指结构的转录因子,在昆虫变态发育中起重要作用。从家蚕5龄第3天幼虫的表皮中克隆了Bm Kr-h1基因,该基因全长c DNA为1 918 bp,其中开放阅读框1 047 bp,GC含量42.2%,编码348个氨基酸。氨基酸序列比对分析发现大部分昆虫物种的Kr-h1都含有8个锌指结构,暗示该蛋白质的功能具有一定的保守性。通过生物信息学方法预测Bm Kr-h1不含信号肽和糖基化位点,但含有19个可能的磷酸化位点,暗示其活性可能受到磷酸化和去磷酸化修饰的影响。利用原核表达系统表达获得了可溶的Bm Kr-h1蛋白并制备了抗体。Western blot和半定量RT-PCR检测的结果显示,不论在mRNA水平还是蛋白质水平,Bm Kr-h1在家蚕幼虫5龄初期和吐丝期的翅原基都有较高水平表达,而在蛹期的表达量较低。用保幼激素(JH)类似物Methoprene和蜕皮激素(20E)分别注射家蚕5龄第3天幼虫,发现2种激素均能诱导蚕体内Bm Kr-h1的表达上调。免疫组织化学结果显示,Bm Kr-h1在5龄第3天幼虫各组织中的表达量很低,而在吐丝期的中肠、脂肪体和表皮中都有一定水平的表达,暗示其可能参与家蚕蜕皮变态的过程。上述结果表明Bm Kr-h1可以响应JH和20E的诱导,提示其在家蚕的变态发育中发挥作用。 展开更多
关键词 家蚕 保幼激素信号途径转录因子 基因克隆 序列结构 诱导表达
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