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基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量:4
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作者 马俊 王志远 +4 位作者 梁杏玲 郑泽中 杨汉春 张桂红 王衡 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4325-4336,共12页
旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原... 旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明^(146) PAEPYTT ^(152)为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2μg·mL^(-1)),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05%PBST溶液稀释5000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 p54蛋白 生物淘选 表位串联多肽 间接ELISA
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1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定 被引量:4
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作者 陈孝军 马俊 +9 位作者 陈熊男 梁祎凡 高琦 黄钊 许润达 郑佳琛 郑泽中 张桂红 王衡 龚浪 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2239-2251,共13页
旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备... 旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为^(84)M~K^(142);噬菌体淘选试验结果表明,^(116)TSSFETLFE^(124)为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体 生物淘选 抗原表位
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非洲猪瘟病毒诱导猪红细胞凋亡并促进猪外周血单核细胞的吞噬作用
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作者 杨云龙 冯永智 +4 位作者 高琦 郑佳琛 王衡 张桂红 龚浪 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期3948-3955,共8页
本研究旨在探讨非洲猪瘟病毒(ASFV)对猪红细胞(RBCs)的作用以及对猪外周血单核细胞(PBMs)吞噬能力的影响。试验采用流式细胞术检测ASFV侵染猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)和猪红细胞(RBCs)的能力,并检测ASFV诱导RBCs发生凋亡的百分比;同时采... 本研究旨在探讨非洲猪瘟病毒(ASFV)对猪红细胞(RBCs)的作用以及对猪外周血单核细胞(PBMs)吞噬能力的影响。试验采用流式细胞术检测ASFV侵染猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)和猪红细胞(RBCs)的能力,并检测ASFV诱导RBCs发生凋亡的百分比;同时采用激光共聚焦试验(Confocal)观察ASFV诱导RBCs发生凋亡是否影响PBMs的吞噬能力。结果显示,ASFV不能入侵RBCs,但以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡。0.1 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导1.27%、3.23%、7.39%和8.56%的RBCs发生凋亡;1 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导1.54%、3.73%、8.46%和10.74%的RBCs发生凋亡;3 MOI ASFV接种RBCs后1、3、5和7 d可分别诱导2.65%、5.01%、12.44%和18.61%的RBCs发生凋亡。同时,凋亡的RBCs可以增加PBMs对黄绿色荧光微球的吞噬数量,ASFV诱导RBCs凋亡的百分比越高,PBMs吞噬黄绿色荧光微球的数量越多。综上所述,ASFV不能侵染猪RBCs,但可以以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡并增强PBMs的吞噬功能。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 猪红细胞 细胞凋亡 吞噬
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