禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的鉴定

1

作者 陈桂娥 容芳 +3 位作者 苟鑫 孙荣航 李作生 陈瑞爱 《动物医学进展》 北大核心 2025年第1期23-28,共6页

为制备禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体,利用原核表达系统表达并纯化ALV p27蛋白,将其作为免疫原免疫注射Balb/c小鼠,用杂交瘤细胞融合和ELISA等筛选出阳性单克隆抗体细胞,对制备的单克隆抗体的抗体亚型、效价及特异性进行鉴... 为制备禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体,利用原核表达系统表达并纯化ALV p27蛋白,将其作为免疫原免疫注射Balb/c小鼠,用杂交瘤细胞融合和ELISA等筛选出阳性单克隆抗体细胞,对制备的单克隆抗体的抗体亚型、效价及特异性进行鉴定,将目的蛋白截短成4段,初步鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,共筛选出4株单克隆细胞,其抗体亚类皆为IgG1型,其中3A1抗体效价为1∶64000,3B2为1∶256000,5F1为1∶128000,5G2为1∶8000;4株单克隆抗体识别的抗原表位在1-60 aa之间。研究结果为进一步建立ALV相关免疫学检测方法提供了重要的材料。 展开更多

关键词 禽白血病病毒 P27蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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与新城疫病毒NP蛋白互作宿主细胞蛋白的筛选和鉴定

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作者 韩银 谢紫葳 +2 位作者 严舒可 徐飞 陈瑞爱 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第8期3942-3957,共16页

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种急性接触性传染病,临床上常导致呼吸系统和消化系统的临床症状,NDV的广泛流行给家禽养殖业造成了巨大经济损失。NP(nucleocapsid)是NDV的一种核衣壳蛋白,在病毒复制... 新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的一种急性接触性传染病,临床上常导致呼吸系统和消化系统的临床症状,NDV的广泛流行给家禽养殖业造成了巨大经济损失。NP(nucleocapsid)是NDV的一种核衣壳蛋白,在病毒复制、介导免疫应答和引发细胞自噬方面具有重要作用,其是否存在其他相互作用的宿主蛋白尚不清楚。为了筛选与NDV NP互作的宿主蛋白,初步探索互作宿主蛋白对NDV复制的影响,为NDV抗病药物新靶点的筛选提供理论基础。利用真核表达载体pXJ40成功构建了NDV NP的真核表达质粒,通过免疫共沉淀、质谱分析、GST-pull down以及激光共聚焦等技术筛选出能与NP相互作用的宿主蛋白,进一步在DF-1细胞中通过敲低、过表达等方法探究互作宿主蛋白对NDV复制的影响。质谱结果筛选到与NP发生相互作用的潜在蛋白211个,对差异蛋白进行富集分析揭示了其可能发挥的生物学功能和参与的生物学过程,进一步验证了热休克蛋白家族成员70(HSP70)与NP相互作用,并且这种互作是由HSP70的SBD结构域介导的;NDV感染能下调宿主细胞内HSP70的表达;过表达HSP70能在蛋白和转录水平显著抑制病毒复制;敲低内源性HSP70和HSP70抑制剂均能显著促进NDV复制。本研究筛选出NDV NP的互作宿主蛋白HSP70,并且验证了过表达HSP70能显著抑制NDV复制,作为NDV感染的负调控因子,为设计以HSP70为靶点的抗病毒药物提供了新思路。 展开更多

关键词 新城疫病毒 NP HSP70蛋白 免疫共沉淀技术

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副猪嗜血杆菌毒力基因及其致病机制研究进展 被引量：3

3

作者 叶俊贤 刘郁夫 +1 位作者 冯夏宁 陈瑞爱 《动物医学进展》 北大核心 2021年第11期90-94,共5页

副猪嗜血杆菌是养猪场重要的细菌性病原之一。副猪嗜血杆菌的致病机制研究主要集中于毒力基因的功能解析和细菌与宿主之间相互作用方面。近年来随着基因组学数据的不断完善,以及对细菌致病机制科学认识的不断深入,科研人员在副猪嗜血杆... 副猪嗜血杆菌是养猪场重要的细菌性病原之一。副猪嗜血杆菌的致病机制研究主要集中于毒力基因的功能解析和细菌与宿主之间相互作用方面。近年来随着基因组学数据的不断完善,以及对细菌致病机制科学认识的不断深入,科研人员在副猪嗜血杆菌致病机制研究方面取得不少进展。论文对最近几年新报道的副猪嗜血杆菌膜蛋白、转录调控机制以及副猪嗜血杆菌与宿主之间互作的相关研究做一综述,可为副猪嗜血杆菌新型防控技术和新药研发提供参考。 展开更多

关键词 副猪嗜血杆菌 毒力基因 致病机制

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共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

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作者 吕亚迪 杨洁 +2 位作者 谢文婷 徐婷 陈瑞爱 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2123-2134,共12页

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF... 旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。 展开更多

关键词 H9N2亚型禽流感病毒 HA蛋白 新城疫病毒 免疫原性 载体疫苗 免疫保护效率

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犬AbernethyⅠ型肝外门静脉分流的诊断及治疗分析 被引量：1

5

作者 李德印 王志刚 +3 位作者 张爱国 汤玉华 孙雅瑞 李世昕 《动物医学进展》 北大核心 2022年第7期139-144,共6页

肝外门静脉分流又称Abernethy畸形,根据肝内门静脉有无分支Abernethy畸形又分为AbernethyⅠ型和AbernethyⅡ型。AbernethyⅠ型在临床上较为罕见,国内外兽医文献中把结扎治疗列为AbernethyⅠ型的手术禁忌症,目前尚未见有关手术治疗的报... 肝外门静脉分流又称Abernethy畸形,根据肝内门静脉有无分支Abernethy畸形又分为AbernethyⅠ型和AbernethyⅡ型。AbernethyⅠ型在临床上较为罕见,国内外兽医文献中把结扎治疗列为AbernethyⅠ型的手术禁忌症,目前尚未见有关手术治疗的报道。作者在临床上接诊1例AbernethyⅠ型门静脉分流患犬,为了探讨该病例的治疗方案,借鉴医学文献中报道的有关方法,以诊断为目的进行手术,使用血管夹暂时阻断分流血管,配合肠系膜静脉造影,在X线下观察到在门静脉压升高的情况下,肝内出现微细的门静脉分支,尝试用Ameroid渐缩环闭合分流血管,最终取得良好的治疗效果。该手术的成功说明肝内门静脉系统存在着潜在的血运重建功能,可为兽医临床上AbernethyⅠ型畸形的诊断和治疗提供参考。 展开更多

关键词 犬 肝外门静脉分流 AbernethyⅠ型 Ameroid渐缩环 手术

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犬左向右动脉导管分流并发严重左心衰的病例报告

6

作者 李德印 王志刚 +4 位作者 杨鹏艳 张爱国 任晓丽 柴春霞 张爱霞 《动物医学进展》 北大核心 2023年第6期129-133,共5页

1只6月龄的边境牧羊犬,发育迟缓,运动不耐受,近期因食欲下降、频繁发生晕厥转至我院就诊。通过病史调查、一般临床检查、实验室检查和影像学检查,患犬确诊为左向右动脉导管分流并发严重左心衰,并伴有肺水肿和疑似肺动脉高压。采取在围... 1只6月龄的边境牧羊犬,发育迟缓,运动不耐受,近期因食欲下降、频繁发生晕厥转至我院就诊。通过病史调查、一般临床检查、实验室检查和影像学检查,患犬确诊为左向右动脉导管分流并发严重左心衰,并伴有肺水肿和疑似肺动脉高压。采取在围手术期持续静脉滴注呋塞米配合口服生理盐水或林格氏液,并择期实施分流导管结扎术的治疗方案。至术后71 d时,患犬恢复良好。诊疗结果表明,该治疗方案可减少术后电解质紊乱等不良反应的发生,对犬PDA合并左心衰的治疗有效可行。 展开更多

关键词 动脉导管分流 围手术期 左心衰 静脉滴注 呋塞米

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wbkD基因缺失影响猪种布鲁菌LPS合成能力和毒力 被引量：1

7

作者 王鑫 刘郁夫 +4 位作者 孙佳丽 冯宇 彭小薇 陈瑞爱 丁家波 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第5期1-7,共7页

wbkD基因在布鲁菌中编码一种糖基转移酶,参与合成布鲁菌LPS的O侧链。为探究wbkD基因与布鲁菌LPS合成和毒力之间的关系,本研究利用同源重组技术构建猪种布鲁菌wbkD基因缺失株。通过吖啶黄凝集试验、结晶紫染色、细菌LPS银染分析比较亲本... wbkD基因在布鲁菌中编码一种糖基转移酶,参与合成布鲁菌LPS的O侧链。为探究wbkD基因与布鲁菌LPS合成和毒力之间的关系,本研究利用同源重组技术构建猪种布鲁菌wbkD基因缺失株。通过吖啶黄凝集试验、结晶紫染色、细菌LPS银染分析比较亲本株和缺失株之间LPS合成能力的差异,并利用小鼠巨噬细胞感染试验和小鼠感染模型,分析wbkD基因缺失对细菌毒力的影响。结果显示,wbkD基因缺失导致布鲁菌由光滑表型转变为粗糙表型,感染后48 h和72 h,ΔwbkD的细胞内存活能力显著弱于亲本株(P<0.001),小鼠感染试验进一步证实,在相同的感染剂量下,感染后1周和4周ΔwbkD在小鼠脾脏和肝脏载菌量均显著低于亲本株(P<0.001)。wbkD基因是布鲁菌合成LPS过程中的关键基因,wbkD基因缺失导致布鲁菌毒力致弱,本研究可为进一步筛选布病疫苗分子修饰靶点提供参考。 展开更多

关键词 布鲁菌 wbkD 基因缺失 LPS 毒力

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Ⅰ群禽腺病毒血清11型的分离鉴定及致病性试验 被引量：5

8

作者 兰虹 任广彩 +6 位作者 叶俊贤 熊挺 何献铭 刘郁夫 杨泽坤 郝文茜 陈瑞爱 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第3期1067-1076,共10页

【目的】了解江苏地区禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)的基因遗传演化情况及致病性,为FAdV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】通过SPF鸡胚盲传、PCR鉴定、电镜观察、全基因组测序、序列比对与相似性分析判定病毒血清分型,并将... 【目的】了解江苏地区禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)的基因遗传演化情况及致病性,为FAdV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】通过SPF鸡胚盲传、PCR鉴定、电镜观察、全基因组测序、序列比对与相似性分析判定病毒血清分型,并将分离株以5×105.33 EID50剂量胸肌注射的方式感染10日龄SPF雏鸡进行动物回归试验。【结果】PCR结果显示,该分离株为Ⅰ群FAdV阳性,在透射电镜下可见球型、无囊膜、具有腺病毒典型的二十面体结构,通过全基因组和Hexon基因进行序列分析表明该分离毒株为FAdV D种血清11型毒株,命名为JSNT-1株。将该毒株感染SPF雏鸡,死亡率为10%(1/10),病死鸡剖检可见肝脏褪色变黄,出血肿胀,边缘钝圆;肾脏肿大出血,苍白等病变。通过实时荧光定量PCR试验可从口腔及泄殖腔中检测到排毒,且病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。病理组织学结果显示,死亡鸡的肝细胞变性坏死,出现嗜碱性核内包涵体;肾小球上皮细胞变性坏死;心肌可见大量炎性细胞浸润。【结论】分离株为FAdV血清11型,感染SPF鸡后临床发病不明显,致死率低,病死鸡能产生特征性的包涵体肝炎病变,且病毒可在鸡体内外进行复制。 展开更多

关键词 禽腺病毒血清11型 包涵体肝炎 分离鉴定 遗传进化分析 致病性

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1株传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 被引量：3

9

作者 何献铭 任广彩 +6 位作者 叶俊贤 兰虹 刘郁夫 熊挺 杨泽坤 徐婷 陈瑞爱 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第3期1005-1014,共10页

【目的】研究1株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)广西分离株的毒力特征及其与VP2基因序列特征的关系,为IBDV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】通过PCR、鸡胚传代培养、DF-1细胞的适应培养及琼脂扩... 【目的】研究1株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)广西分离株的毒力特征及其与VP2基因序列特征的关系,为IBDV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】通过PCR、鸡胚传代培养、DF-1细胞的适应培养及琼脂扩散试验等方法分离鉴定病毒,并扩增其VP2基因,利用Mega 7.0、MegAlign软件将其与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及氨基酸序列比对分析,并进行SPF鸡致病性试验,用实时荧光定量PCR方法测定IBDV拷贝数变化情况。【结果】成功分离到1株IBDV毒株,命名为GX20210126株。该毒株接种SPF鸡胚可导致鸡胚出现出血、矮化和肝脏发黄、出血及针尖状坏死;且GX20210126对DF-1具有良好的细胞适应性,可引起显著细胞病变。琼脂扩散试验显示,该毒株具有良好的抗原性,病毒液能与IBDV阳性血清之间形成白色沉淀线。VP2基因进化分析显示GX20210126株与国际标准超强毒株在同一个大的分支上,氨基酸序列相似性在86.8%~99.6%之间,其中与UK661株相似性最高,为99.6%,仅有2处氨基酸位点发生改变,即D279N和I272T。以EID50为10-3.8/0.1 mL,0.5 mL/只的剂量点眼、滴鼻接种8日龄SPF鸡,攻毒后鸡出现羽毛蓬松、精神萎靡、拉白绿色水样粪便等临床症状,剖检可见肌肉、肝脏出血,肾脏尿酸盐沉积,法氏囊萎缩,IBDV拷贝数在感染后第5天达到峰值。【结论】IBDV广西流行株GX20210126具有超强毒株基因序列特征,人工感染鸡群可导致IBDV典型临床症状和病理变化。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2蛋白 分离鉴定 序列分析

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非洲猪瘟病毒p72蛋白原核表达及单克隆抗体制备 被引量：1

10

作者 陈桂娥 容芳 +7 位作者 冯夏宁 孙荣航 马绍钊 郝文茜 叶子安 刘郁夫 李作生 陈瑞爱 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4646-4654,共9页

【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将... 【目的】表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p72蛋白,并制备其单克隆抗体。【方法】构建原核表达载体pET-28b-p72,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行诱导表达和蛋白纯化;用纯化后的p72蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合并制备单克隆抗体,通过间接ELISA法和亚克隆筛选出分泌抗体的阳性杂交瘤细胞;通过小鼠抗体类型检测试剂盒检测抗体类型;通过体内诱生法制备抗ASFV p72蛋白的单克隆抗体腹水,使用饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,通过间接ELISA法、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting检测单克隆抗体效价和特异性。【结果】ASFV p72重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,将纯化的p72蛋白制备单克隆抗体,获得4株分泌IgG1抗体的单克隆细胞株,分别命名为6F8、7C3、8H7和9G2。间接ELISA结果显示,6F8与8H7细胞株分泌的抗体效价均为1∶6400,7C3与9G2细胞株的抗体效价均为1∶12800,且4株细胞株分泌的抗体与p72蛋白反应结果均呈阳性,与猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)反应均呈阴性。4株单克隆细胞株分泌的抗体均能与p72真核蛋白发生特异性反应。【结论】本研究成功制备了4株能稳定分泌与ASFV p72蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究ASFV p72蛋白的功能以及非洲猪瘟的防控和诊断建立了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 原核表达 单克隆抗体

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牛种布鲁氏菌ClpS基因突变株的构建及其对毒力的影响

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作者 刘郁夫 董浩 +4 位作者 孙石静 彭小薇 陈瑞爱 丁家波 蒋卉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第11期3767-3773,共7页

试验旨在探究ClpS基因在布鲁氏菌中的作用,分析比较ClpS基因突变对布鲁氏菌毒力的影响。利用同源重组技术,构建布鲁氏菌ClpS基因突变株,通过检测细菌生长曲线、细菌LPS合成能力及其在巨噬细胞内的存活能力和小鼠模型中的毒力,比较亲本株... 试验旨在探究ClpS基因在布鲁氏菌中的作用,分析比较ClpS基因突变对布鲁氏菌毒力的影响。利用同源重组技术,构建布鲁氏菌ClpS基因突变株,通过检测细菌生长曲线、细菌LPS合成能力及其在巨噬细胞内的存活能力和小鼠模型中的毒力,比较亲本株2308和突变株ΔClpS两者之间的差异。结果显示,在相同的培养条件下,亲本株2308和突变株ΔClpS的细菌浓度无明显差异,且两者提取的LPS银染结果基本一致,表明ClpS基因突变不影响布鲁氏菌生长速度,不影响细菌LPS合成;在细胞感染模型中,突变株ΔClpS在感染后72 h的胞内存活能力极显著低于亲本株2308(P<0.01);小鼠感染试验显示,在感染后1周,亲本株2308感染组和突变株ΔClpS感染组小鼠脾脏重量及细菌含量无显著差异,但在感染后4周,突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏细菌含量为103.93 CFU/g脾脏,显著低于亲本株2308(106.68 CFU/g脾脏,P<0.01),且突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏肿胀程度极显著低于亲本株2308(P<0.01)。综上所述,布鲁氏菌ClpS基因突变不影响细菌生长速度及细菌LPS合成能力,但ClpS基因突变可降低布鲁氏菌在小鼠脾脏内的定殖能力。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 ClpS基因 基因突变 毒力

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猪圆环病毒3型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：4

12

作者 杨斌 黄红亮 +1 位作者 方倪然 陈瑞爱 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第10期20-24,共5页

为了提高检测猪圆环病毒3型(PCV3)的稳定性、特异性和灵敏度,本试验根据猪圆环病毒3型分离株PCV3-Hebei-LY_(2)015(GenBank登录号:MF318451.1)Cap蛋白保守区域设计了特异性引物和探针,建立了PCV3 TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法最... 为了提高检测猪圆环病毒3型(PCV3)的稳定性、特异性和灵敏度,本试验根据猪圆环病毒3型分离株PCV3-Hebei-LY_(2)015(GenBank登录号:MF318451.1)Cap蛋白保守区域设计了特异性引物和探针,建立了PCV3 TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法最低可检测到11.8 copies/μL,经过组内和组间重复试验两者变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性;与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性;对临床疑似PCV3阳性病料检测结果表明该方法具有良好的敏感性。本试验建立的方法为PCV3临床检测及对发病猪只各个器官的病毒载量监测提供了快速、准确的检测依据。 展开更多

关键词 猪圆环病毒3型 临床检测 特异性 荧光定量PCR

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H5亚型禽流感病毒HA蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达与纯化

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作者 刘郁夫 陈晓洁 +3 位作者 区炳明 容芳 郝文茜 陈瑞爱 《动物医学进展》 北大核心 2023年第10期19-24,共6页

为表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-HA重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组HA基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表... 为表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-HA重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组HA基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表达的HA蛋白进行鉴定。结果表明表达的重组HA蛋白均能与抗Strep标签抗体、H5亚型禽流感病毒阳性血清(Re-11株)特异性结合,且HA重组蛋白在昆虫细胞中以细胞分泌上清的形式表达,红细胞凝集效价为1∶64,利用链霉素亲和层析的方法,纯化重组HA蛋白,纯化后HA蛋白浓度为0.364 mg/mL。试验结果可为禽流感病毒亚单位疫苗研制、HA蛋白单克隆抗体制备提供前期基础。 展开更多

关键词 H5亚型禽流感病毒 HA蛋白 杆状病毒 蛋白表达

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表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

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作者 徐婷 熊挺 +5 位作者 李淋雨 刘郁夫 温良海 谢文婷 杨泽坤 陈瑞爱 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第12期1424-1434,共11页

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源... 【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2;将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-VP2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病 VP2蛋白 重组复制缺陷型人5型腺病毒

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