目的:研究指出蛋白激酶Cγ(PKCγ)在脊髓水平上参与了伤害性信号的传递,文中拟构建大鼠PKCγ基因的小发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,并在细胞水平鉴定其干扰效率。方法:根据PKCγ-mRNA序列,选择3条19nt的靶序列,设计并合成包含正、反义靶序...目的:研究指出蛋白激酶Cγ(PKCγ)在脊髓水平上参与了伤害性信号的传递,文中拟构建大鼠PKCγ基因的小发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,并在细胞水平鉴定其干扰效率。方法:根据PKCγ-mRNA序列,选择3条19nt的靶序列,设计并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入到pLVTHM载体的H1启动子后获得重组质粒,同时构建一个非特异性对照质粒。将所构建的质粒与pMDLg-pRRE、pR sv-REV、pMD2G共转染293T细胞,包装产生慢病毒后,分别感染C6细胞,经免疫印迹技术(W estern b lot)检测PKCγ基因的蛋白表达水平以评价慢病毒载体的抑制效率。结果:测序证实成功构建了3个大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,分别感染C6细胞后pLV-PKC2和pLV-PKC3可明显降低PKCγ蛋白的表达,其中以pLV-PKC2(靶向位点:+1913^+1931)的慢病毒抑制效率最高。结论:成功构建了大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,且慢病毒载体pLV-PKC2能特异、高效地抑制PKCγ基因的表达。展开更多
文摘目的:研究指出蛋白激酶Cγ(PKCγ)在脊髓水平上参与了伤害性信号的传递,文中拟构建大鼠PKCγ基因的小发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,并在细胞水平鉴定其干扰效率。方法:根据PKCγ-mRNA序列,选择3条19nt的靶序列,设计并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入到pLVTHM载体的H1启动子后获得重组质粒,同时构建一个非特异性对照质粒。将所构建的质粒与pMDLg-pRRE、pR sv-REV、pMD2G共转染293T细胞,包装产生慢病毒后,分别感染C6细胞,经免疫印迹技术(W estern b lot)检测PKCγ基因的蛋白表达水平以评价慢病毒载体的抑制效率。结果:测序证实成功构建了3个大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,分别感染C6细胞后pLV-PKC2和pLV-PKC3可明显降低PKCγ蛋白的表达,其中以pLV-PKC2(靶向位点:+1913^+1931)的慢病毒抑制效率最高。结论:成功构建了大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,且慢病毒载体pLV-PKC2能特异、高效地抑制PKCγ基因的表达。
