甲胎蛋白DNA疫苗的构建及诱导小鼠抗肿瘤免疫的实验研究 被引量：2

1

作者 田耕 易继林 熊平 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第15期1591-1594,共4页

目的克隆小鼠甲胎蛋白(murineα-fetoprote in,mAFP)基因,构建mAFP DNA疫苗并检测其诱导mAFP特异性CTL反应及抗肿瘤免疫的能力。方法利用RT-PCR从Hepa 1-6细胞总RNA中克隆出mAFP基因,亚克隆于pcD-NA3.1中构建DNA疫苗pmAFP,酶切、测序和... 目的克隆小鼠甲胎蛋白(murineα-fetoprote in,mAFP)基因,构建mAFP DNA疫苗并检测其诱导mAFP特异性CTL反应及抗肿瘤免疫的能力。方法利用RT-PCR从Hepa 1-6细胞总RNA中克隆出mAFP基因,亚克隆于pcD-NA3.1中构建DNA疫苗pmAFP,酶切、测序和表达鉴定;pmAFP稳定转染EL-4细胞建立EL-4(mAFP)细胞系;pmAFP免疫小鼠,接种EL-4(mAFP)细胞,观察肿瘤生长情况;E lispot法检测免疫后小鼠脾脏细胞中产生IFN-γ的细胞频数;另外,对免疫的小鼠采血进行肝、肾功能检测。结果RT-PCR成功克隆出小鼠AFP基因;酶切、测序和表达鉴定证实DNA疫苗pmAFP构建成功;RT-PCR证实EL-4(mAFP)细胞中有mAFP mRNA的表达;pmAFP免疫组小鼠的肿瘤体积(1 042.42±123.71)mm3明显小于pcDNA3.1组(P<0.01)和PBS组(P<0.01);pmAFP免疫小鼠的脾脏细胞产生IFN-γ的细胞频数显著高于pcDNA3.1组(P<0.01)和PBS组(P<0.01)。各组肝、肾功能无显著差异。结论mAFP DNA疫苗构建成功,此疫苗能诱导AFP特异性的CTL增殖并诱导小鼠产生明显的抗肿瘤免疫力,对小鼠肝、肾功能不产生影响。 展开更多

关键词 疫苗 脱氧核糖核酸 甲胎蛋白 小鼠 免疫治疗

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日本血吸虫混合DNA疫苗pBK-CMV-Sj26/Sj32诱导小鼠的免疫应答 被引量：1

2

作者 李柳哲 石佑恩 +1 位作者 江侃 宁长修 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2002年第1期36-38,共3页

目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾... 目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾细胞作T淋巴细胞转化实验 ;在 0w、3w和 6w经小鼠尾静脉取血 ,ELISA检测血清中抗体效价及阳性反应率。结果　淋巴细胞转化实验示血吸虫成虫抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞 ;第一次免疫后特异性抗体效价开始升高。抗体最高效价为 1∶2 0 ,3次免疫后有 91.7%小鼠血清呈阳性反应。结论　真核载体 pBK -CMV -Sj2 6 展开更多

关键词 日本血吸虫 Sj26/Sj32 混合DNA疫苗 免疫应答

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跨膜型SCF与分泌型SCF对肥大细胞生物学功能影响的研究 被引量：3

3

作者 郑浩 李卓娅 +4 位作者 龚非力 姜晓丹 冯玮 徐勇 熊平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第8期404-407,共4页

目的 :比较两型SCF对肥大细胞增殖 ,分泌组胺及产生细胞因子等功能的影响 ,探讨二型SCF在对肥大细胞生物学功能影响的异同。方法 :用MTT法 ,荧光法和原位杂交法分别检测二型SCF对肥大细胞的增殖作用 ,组胺分泌及TNF αmR NA的表达。结... 目的 :比较两型SCF对肥大细胞增殖 ,分泌组胺及产生细胞因子等功能的影响 ,探讨二型SCF在对肥大细胞生物学功能影响的异同。方法 :用MTT法 ,荧光法和原位杂交法分别检测二型SCF对肥大细胞的增殖作用 ,组胺分泌及TNF αmR NA的表达。结果 :分泌型SCF可明显促进肥大细胞增殖 ,组胺分泌及TNF αmRNA的表达 ;而跨膜型SCF则仅对组胺分泌有较弱的促进作用 ,对肥大细胞的其他两项功能无影响。结论 展开更多

关键词 肥大细胞 干细胞因子 增殖 组胺 TNF-Α MRNA

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稳定高效表达TNF-α基因及其突变体的H22肿瘤细胞株的建立 被引量：2

4

作者 李清芬 李卓娅 +4 位作者 龚非力 姜晓丹 徐勇 冯玮 熊平 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期210-213,共4页

目的建立转染3种TNF-α基因(分泌型TNF-α突变体、跨膜型TNF-α突变体和野生型TNF-α的H22细胞株,以比较不同类型TNF-α的杀瘤效应。方法采用逆转录病毒载体,将3种TNF-α基因导入小鼠H22肿瘤细胞中,用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞术... 目的建立转染3种TNF-α基因(分泌型TNF-α突变体、跨膜型TNF-α突变体和野生型TNF-α的H22细胞株,以比较不同类型TNF-α的杀瘤效应。方法采用逆转录病毒载体,将3种TNF-α基因导入小鼠H22肿瘤细胞中,用Southern印迹、RT-PCR、流式细胞术和生物学活性检测等方法,从基因的整合、RNA转录、蛋白的表达及其生物学活性4个方面,对转染细胞进行检测鉴定。结果3种TNF-α基因均在H22细胞中得到有效表达,并具有生物学活性。结论获得3种稳定高效表达TNF-α的H22肿瘤细胞株,为进一步研究跨膜型和分泌型TNF-α体内的抑瘤效应建立了良好的实验模型。 展开更多

关键词 跨膜型TNF-Α 分泌型TNF-Α 逆转录病毒载体 肿瘤 H22细胞 细胞毒效应

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CTL对同种异体靶细胞杀伤作用的实验研究 被引量：2

5

作者 房崇芸 吴雄文 +4 位作者 韩军艳 刘敏 杨志章 梁智辉 龚非力 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期119-122,共4页

目的 :研究特异性CTL杀伤的效应与HLA型别之间的关系。方法 :用已知型别的EB病毒转化的B淋巴母样细胞 (Epstein Barr transformedBlymphoblastoidcellline ,EBV LCL)与同种异体外周血单个核细胞 (PBMC)共培养 ,激活同种异体抗原特异性... 目的 :研究特异性CTL杀伤的效应与HLA型别之间的关系。方法 :用已知型别的EB病毒转化的B淋巴母样细胞 (Epstein Barr transformedBlymphoblastoidcellline ,EBV LCL)与同种异体外周血单个核细胞 (PBMC)共培养 ,激活同种异体抗原特异性细胞毒性T细胞 (cytotoxicityTcell,CTL) ,然后利用同位素释放法观察CTL对HLA I类表型不同的EBV LCL的杀伤活性。结果 :用EBV LCL 1刺激自身PBMC 1所诱导的CTL 1a,只能杀伤EBV LCL 1,而不能杀伤HLA I类表型不同的EBV LCL 2 ;但用EBV LCL 2刺激PBMC 1所诱导的CTL 1b ,却能有效杀伤HLA I类表型不同的EBV LCL 2。结论 :①MHC表型不同的免疫细胞之间可以发生相互作用 ;②TCR既不单独识别靶细胞表面的抗原肽 ,也不直接识别靶细胞表面的MHC分子 (MHC特异性抗原决定簇 ) ,而是识别MHC 抗原肽复合物的表面综合信息 ,后者可能是由MHC 抗原肽复合物表面的空间构象、电荷性质及其分布等信息所构成 ;③所谓CTL的特异性杀伤作用 ,是MHC 抗原肽复合物表面信息激活该信息特异性T细胞克隆的结果。 展开更多

关键词 CTL限制性杀伤 HLA型别 TCR MHC-抗原肽复合物 表面信息

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抗CD4抗体对SEB诱导的PBMC增殖反应的抑制作用机理 被引量：1

6

作者 张智红 沈关心 +2 位作者 杨敬 朱慧芬 张悦 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期176-179,共4页

目的 :探讨抗CD4抗体在SEB诱导的外周血单个核细胞 (PBMC)增殖反应中的作用机理。方法 :采用MTT法 ,以SEB为刺激原 ,观测在不同条件诱导的PBMC增殖反应中抗CD4抗体的作用。采用形态学、生物化学、流式细胞仪等方法 ,检测抗CD4抗体诱导的... 目的 :探讨抗CD4抗体在SEB诱导的外周血单个核细胞 (PBMC)增殖反应中的作用机理。方法 :采用MTT法 ,以SEB为刺激原 ,观测在不同条件诱导的PBMC增殖反应中抗CD4抗体的作用。采用形态学、生物化学、流式细胞仪等方法 ,检测抗CD4抗体诱导的CD4+ T细胞凋亡。结果 :抗CD4人 鼠嵌合抗体和鼠源性单抗对由SEB诱导的PBMC增殖均有抑制作用。嵌合抗体能特异性诱导CD4+ T细胞发生凋亡。结论 :抗CD4抗体的增殖抑制作用能直接作用于TCR诱导的早期活化信号 ,嵌合抗体的抑制作用强度与单核细胞的存在密切相关 ,抗CD4嵌合抗体的进一步广泛交联是诱导凋亡的关键。 展开更多

关键词 嵌合抗体 鼠源性单抗 细胞增殖抑制效应 CD4^+T细胞 细胞凋亡 SEB 抗CD4抗体

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HLA-DRB1等位基因多态性与食管癌遗传易感性研究 被引量：2

7

作者 林军 孙洁 +4 位作者 周燕 黄星 熊平 汪亚平 邓长生 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第9期1112-1114,共3页

目的 :从基因水平探讨湖北地区汉族人食管癌HLA -DRB1等位基因的遗传易感性。方法 :运用序列特异性引物聚合酶链反应结合基因序列分析等技术 ,检测无亲缘关系湖北汉族健康人 136例、食管癌组 4 2例患者的HLA -DRB1等位基因。SAS统计软... 目的 :从基因水平探讨湖北地区汉族人食管癌HLA -DRB1等位基因的遗传易感性。方法 :运用序列特异性引物聚合酶链反应结合基因序列分析等技术 ,检测无亲缘关系湖北汉族健康人 136例、食管癌组 4 2例患者的HLA -DRB1等位基因。SAS统计软件数据处理。结果 :湖北地区汉族人食管癌患者与正常人比较 ,HLA -DRB1 0 90 1基因频率显著增高 (0 2 5 0 0vs 0 1397,P =0 0 2 8,OR =2 0 5 3,病因分数 =0 12 82 ) ;两者间其余HLA -DRB1等位基因分布频率差别均无显著。结论 :HLA -DRB1 0 90 1等位基因与湖北地区汉族人食管癌正相关 ,为其易感基因 ,该等位基因测序结果与其基因库第 2外显子序列吻合。 展开更多

关键词 HLA-DRB1等位基因多态性 食管癌 遗传易感性

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人可溶性TNF受体(sTNFRI)在大肠杆菌中的表达及其活性鉴定 被引量：1

8

作者 叶飞 李卓娅 +5 位作者 尹丙姣 龚非力 姜晓丹 冯玮 徐勇 熊平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第11期743-746,共4页

目的 :构建人可溶性TNF受体I(sTNFRI)基因表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达。方法 :用RT PCR扩增编码人TNFRI胞外段基因片段 ,将其插入到表达载体pET 2 8a ,并转入大肠杆菌进行表达。结果 :在IPTG诱导下 ,转入外源基因的大肠杆菌BL 2 ... 目的 :构建人可溶性TNF受体I(sTNFRI)基因表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达。方法 :用RT PCR扩增编码人TNFRI胞外段基因片段 ,将其插入到表达载体pET 2 8a ,并转入大肠杆菌进行表达。结果 :在IPTG诱导下 ,转入外源基因的大肠杆菌BL 2 1可高效表达sTNFRI蛋白 ,SDS PAGE显示在 2 7kD处有一特异表达条带 ,其表达量占菌体蛋白总量的 31%。纯化的sTNFRI可有效封闭TNF对L92 9细胞的胞毒效应 ;间接免疫荧光显示它可特异性抑制TNF与靶细胞TNFR的结合。结论 :通过基因工程技术获得了人sTNFRI重组蛋白。 展开更多

关键词 人可溶性TNF受体 大肠杆菌 表达 活性鉴定 胞毒效应

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跨膜型TNF-α细胞毒作用与其功能域的关系 被引量：1

9

作者 郑芳 李卓娅 +4 位作者 龚非力 姜晓丹 熊平 冯玮 徐勇 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期225-227,231,共4页

目的 :探讨跨膜型TNF α(TM TNFα)的细胞毒作用及其功能域的关系。方法 :采用重组PCR对TM TNFα基因进行定点突变 ,在微粒体膜的存在下体外转录、翻译突变体 ,并观察这些突变体的胞毒作用。结果 :通过重组PCR分别获得TM TNFα第 - 71... 目的 :探讨跨膜型TNF α(TM TNFα)的细胞毒作用及其功能域的关系。方法 :采用重组PCR对TM TNFα基因进行定点突变 ,在微粒体膜的存在下体外转录、翻译突变体 ,并观察这些突变体的胞毒作用。结果 :通过重组PCR分别获得TM TNFα第 - 71、31、35、87、95、14 3与 14 7位氨基酸置换的突变体 ,这 7种突变体对L92 9细胞系的细胞毒作用 ,与野生型TM TNFα相比 :第 - 71、14 3位氨基酸单个置换使TM TNFα胞毒作用下降 4倍以上 ,35、95、14 7位单个置换使TM TNFα胞毒作用下降1 5～ 2 5倍 ;而第 31、87与 133位氨基酸突变则对TM TNFα杀伤作用无影响。结论 :除 - 71位氨基酸外 ,以上 6个位点的氨基酸均参与分泌型TNF α(S TNFα)的胞毒功能 ,提示TM TNFα和S TNFα发挥细胞毒功能的功能域可能不完全相同。 展开更多

关键词 跨膜型 TNF-α细胞毒作用 功能域 关系

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两型TNF-α的细胞毒效应与靶细胞内Ca^(2+)浓度变化的关系 被引量：1

10

作者 石文芳 尹丙姣 +2 位作者 熊平 龚非力 李卓娅 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期537-539,共3页

目的 :比较分泌型TNF α(S TNF α)和跨膜型TNF α(TM TNF α)发挥细胞毒效应时 ,引起靶细胞内Ca2 + 浓度的变化。方法 :采用生物学活性检测法 ,观察两型TNF α对不同靶细胞的杀伤效应 ;用Fura 2检测细胞内Ca2 + 浓度的变化。结果 :TM T... 目的 :比较分泌型TNF α(S TNF α)和跨膜型TNF α(TM TNF α)发挥细胞毒效应时 ,引起靶细胞内Ca2 + 浓度的变化。方法 :采用生物学活性检测法 ,观察两型TNF α对不同靶细胞的杀伤效应 ;用Fura 2检测细胞内Ca2 + 浓度的变化。结果 :TM TNF α可杀伤实验所用 6株靶细胞 ;而S TNF α则仅对其中两株有细胞毒效应。两型TNF α杀伤靶细胞时 ,均伴有明显的Ca2 + 浓度升高。用钙螯合剂EGTA(10mmol/L)预先处理靶细胞30min ,只能降低S TNF α作用的靶细胞内的Ca2 + 浓度 ,并使其细胞毒效应明显减弱 (P <0 .0 1) ;对TM TNF α无影响。结论 :两型TNF α发挥细胞毒效应时 ,均可引起靶细胞内钙离子的重分布 ,导致靶细胞内Ca2 + 浓度的升高 ,但S TNF α的作用还可能与促进胞外Ca2 + 展开更多

关键词 跨膜型TNF-Α 分泌型TNF-Α 细胞毒效应 CA^2+

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卵巢癌细胞对CD8^＋T细胞ζ链表达及分泌Tc1／Tc2型细胞因子的影响 被引量：1

11

作者 汪辉 黄亚非 +3 位作者 李天 李晓 程琪 谢幸 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期97-100,共4页

目的:通过研究卵巢癌细胞对CD8+ T细胞ζ链表达及分泌Tc1/Tc2型细胞因子影响,探讨其在卵巢癌免疫抑制中的作用。方法:Western印迹方法检测3株卵巢癌细胞(OVCAR3、CAOV3和SKOV3)培养上清液作用后CD8+ T细胞ζ链蛋白的表达;分别采用MTT、... 目的:通过研究卵巢癌细胞对CD8+ T细胞ζ链表达及分泌Tc1/Tc2型细胞因子影响,探讨其在卵巢癌免疫抑制中的作用。方法:Western印迹方法检测3株卵巢癌细胞(OVCAR3、CAOV3和SKOV3)培养上清液作用后CD8+ T细胞ζ链蛋白的表达;分别采用MTT、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法观察卵巢癌细胞培养上清液对CD8+ T细胞增殖和分泌Tc1/Tc2型细胞因子的影响。结果:(1)与对照组比较,OVCAR3、CAOV3和SK-OV3细胞培养上清液均能抑制CD8+ T细胞中ζ链的表达,ζ链蛋白平均吸光度值分别为(0.346±0.004;0.349±0.007;0.387±0.011;0.616±0.013);(2)3株卵巢癌细胞培养上清液皆抑制CD8+ T细胞增殖,分泌的Tc1细胞因子IFN-γ显著降低,而Tc2细胞因子IL-10显著增高。结论:卵巢癌细胞源性的免疫抑制因子通过下调CD8+ T细胞ζ链的表达,从而抑制其增殖并导致Tc1/Tc2细胞因子分泌失衡,这可能是卵巢癌诱导腹腔免疫抑制的机制之一。 展开更多

关键词 卵巢肿瘤 免疫抑制 CD8^+T细胞 ζ链

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转染肿瘤坏死因子α及其突变体基因对H22肿瘤细胞体内致瘤能力的影响

12

作者 李清芬 李卓娅 +4 位作者 龚非力 徐勇 姜晓丹 冯玮 熊平 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第8期710-713,共4页

目的 :比较转染野生型TNF - (Wt-TNF)及多种突变体 ,包括分泌型TNF -α突变体 (S -TNFm)、跨膜型TNF -α突变体 (TM -TNFm)基因后 ,H2 2细胞体内致瘤能力 ,并探讨其可能的机制。方法 :将表达TNF -α及其突变体的H2 2细胞分别与未转染基... 目的 :比较转染野生型TNF - (Wt-TNF)及多种突变体 ,包括分泌型TNF -α突变体 (S -TNFm)、跨膜型TNF -α突变体 (TM -TNFm)基因后 ,H2 2细胞体内致瘤能力 ,并探讨其可能的机制。方法 :将表达TNF -α及其突变体的H2 2细胞分别与未转染基因的H2 2细胞以不同比例混合 ,2 .5× 10 5(10 0 μL)接种于小鼠体内 ,观察肿瘤的生长情况 ;并用免疫组化检测肿瘤局部淋巴细胞浸润和肿瘤细胞表达Fas和CD44V。结果 :转染TNF -α及其突变体基因的肿瘤细胞的致瘤能力均明显减弱 (P <0 .0 1) ;除二型TNF对瘤细胞的胞毒效应外 ,TM -TNFm 可诱导肿瘤细胞表达死亡受体Fas,而S -TNFm 则可明显促进肿瘤灶局部淋巴细胞的浸润 (P <0 0 1)。此外 ,注射H2 2 /S -TNFm细胞 ,小鼠出现一过性体重下降。结论 :转染TM -TNFm 和S -TNFm 基因肿瘤细胞的致瘤能力明显降低 ,其原因除与二者胞毒效应有关外 ,前者可能通过Fas途径导致瘤细胞凋亡 。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子 基因表达 淋巴细胞 肿瘤 TNF-Α 基因疗法

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HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导

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作者 汪涯雅 张东华 +6 位作者 刘文励 周红升 张路 戴敏 黄振倩 谭获 熊平 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第6期1178-1182,共5页

本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点,构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞,用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性,通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞,构建树突状细... 本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点,构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞,用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性,通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞,构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL,应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型,能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后,Westernblot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。 展开更多

关键词 树突状细胞 HA-1基因 树突状细胞核酸疫苗 造血干细胞移植 细胞毒性T淋巴细胞

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