应用在大肠杆菌中表达的猪2型圆环病毒ORF2蛋白建立一种ELISA诊断方法 被引量：18

1

作者 琚春梅 陈焕春 +2 位作者 刘正飞 曹胜波 何启盖 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期689-693,共5页

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV2)序列(AY035820),设计1对引物,并以包含PCV2全基因组的重组质粒pT-PCV为模板,扩增出含ORF2全基因的片段(709bp),回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,获得重组质粒pTORF2,并对其进行序列测定。重组质粒经... 根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV2)序列(AY035820),设计1对引物,并以包含PCV2全基因组的重组质粒pT-PCV为模板,扩增出含ORF2全基因的片段(709bp),回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,获得重组质粒pTORF2,并对其进行序列测定。重组质粒经Bal 和Sal 双酶切,回收ORF2基因,将其插入pGEX-KG的Sma 和Sal 位点间,构建原核表达质粒pGEXORF2,阳性重组质粒转化E.coliBL21(DE3),进行原核表达。用此表达产物包被酶标板,建立ELISA诊断方法,并对临床676份送检血清进行了检测,结果表明其总阳性率为62.7%(424/676),仔猪阳性率为38.9%(74/190),肥猪阳性率为63.2%(84/133),母猪阳性率为74.6%(249/334),公猪阳性率为89.5%(17/19)。 展开更多

关键词 阳性率 重组质粒 诊断方法 ELISA 表达 蛋白 基因 ORF2 圆环病毒 PCV2

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猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究 被引量：13

2

作者 宋云峰 肖少波 +2 位作者 金梅林 张松林 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1049-1054,共6页

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,命名为pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2。... PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,命名为pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠,分别注射pCD-NA3.1(+)、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2,共免疫2次,间隔2周,分别于首免后2周和二免后4周采血,ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达,将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体,构建了pNORF2和pNBVP22,转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示,通过两次免疫后,各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体,同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果,其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。 展开更多

关键词 猪2型圆环病毒ORF2 BVP22 蛋白转导 核酸疫苗

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伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究 被引量：10

3

作者 张辉 方六荣 +4 位作者 赵骞 薛念波 江云波 肖少波 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期369-375,共7页

UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV-Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的U... UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV-Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。 展开更多

关键词 伪狂犬病毒 UL14 突变株 生物学特性

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共表达与牛疱疹病毒1型VP22融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒E及M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫原性观察 被引量：7

4

作者 赵武 肖少波 +5 位作者 方六荣 江云波 宋云峰 严琳 余晓岚 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期401-407,共7页

为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程疫苗,以伪狂犬病毒(PRV)gE基因缺失标志疫苗株TK-/gE-/LacZ+为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22(BHV-1 VP22)融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒(rPRV)TK-/gE-/... 为了研制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程疫苗,以伪狂犬病毒(PRV)gE基因缺失标志疫苗株TK-/gE-/LacZ+为病毒载体,通过同源重组,构建了共表达与牛疱疹病毒1型VP22(BHV-1 VP22)融合的PRRSV E及M蛋白的重组伪狂犬病毒(rPRV)TK-/gE-/VP22E+/VP22M+。经PCR、Southern blot、Westernblot证实rPRV构建正确,并能表达与BHV-1 VP22融合的PRRSV E及M蛋白。rPRV在IBRS-2、PK-15细胞中的增殖滴度与PRV亲本株相比无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV增殖。用该rPRV免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠抗PRRSV中和抗体及脾淋巴细胞增殖反应,并与未融合VP22的单表达PRRSV E蛋白及共表达E及M蛋白的rPRV TK-/gE-/E+与TK-/gE-/E+/M+进行比较。结果显示TK-/gE-/VP22E+/VP22M+可诱导小鼠产生更好的体液与细胞免疫反应,BHV-1 VP22发挥了佐剂效应。本研究为研制安全、有效的猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 牛疱疹病毒1型VP22 猪繁殖与呼吸综合征病毒 修饰型ORF5基因 ORF6基因 重组伪狂犬病毒

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伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达 被引量：2

5

作者 马相如 胡勤芹 +2 位作者 肖少波 方六荣 陈焕春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期86-89,共4页

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1000bp片段,扩增产物克隆于pMD18＿T中,双脱氧末端终止法序列测定。通过OM1GA2 0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30 38kD,与Ka株UL31基因核苷酸... 以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1000bp片段,扩增产物克隆于pMD18＿T中,双脱氧末端终止法序列测定。通过OM1GA2 0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30 38kD,与Ka株UL31基因核苷酸与氨基酸序列同源性均在98%以上。将α＿疱疹病毒亚科9个不同成员UL31同源基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析,发现4个保守的功能性结构域。将该片段插入原核表达载体pGEX＿KG中GST下游,构建的原核表达质粒pGEX＿UL31在大肠杆菌BL32(DE3)中获得了高效表达,SDS＿PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为56kD。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 UL31基因 克隆 序列分析 表达

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猪圆环病毒I型ORF2蛋白序列与其核定位功能的相关性 被引量：2

6

作者 陈美玲 陈焕春 +1 位作者 宋云峰 黄红亮 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期459-461,共3页

软件分析PCV1-ORF2的核苷酸序列发现其N端的氨基酸序列中包含一段核定位序列,将具有核定位序列特征的区域删除,构建缺失核定位序列的PCV1-ORF2基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,同时构建PCV1-ORF2全基因与绿色荧光蛋白的真核融合... 软件分析PCV1-ORF2的核苷酸序列发现其N端的氨基酸序列中包含一段核定位序列,将具有核定位序列特征的区域删除,构建缺失核定位序列的PCV1-ORF2基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,同时构建PCV1-ORF2全基因与绿色荧光蛋白的真核融合表达载体,分别转染Hela细胞,可观察到后者绿色荧光聚集在细胞核区域;而前者转染Hela细胞结果显示核定位现象消失,从而可以推断这一区域是CPV1-ORF2蛋白核定位的功能区。 展开更多

关键词 猪圆环病毒Ⅰ型 ORF2蛋白 HELA细胞 绿荧光蛋白 核定位序列

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逆转录病毒介导的PrVEa株gD基因转基因细胞系的建立 被引量：1

7

作者 石德时 兰盛银 +2 位作者 洪文洲 吴美洲 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期48-53,共6页

采用逆转录病毒介导的方法,将PrVEa株gD基因整合进PK 15细胞染色体中,建立起表达gD蛋白的细胞系PKD。通过荧光观察,发现PKD表达的gD分布在细胞膜上,具备原有的免疫反应性;同时,还发现gD蛋白在PKD细胞膜上呈明显极性分布。PCR技术和间接... 采用逆转录病毒介导的方法,将PrVEa株gD基因整合进PK 15细胞染色体中,建立起表达gD蛋白的细胞系PKD。通过荧光观察,发现PKD表达的gD分布在细胞膜上,具备原有的免疫反应性;同时,还发现gD蛋白在PKD细胞膜上呈明显极性分布。PCR技术和间接免疫荧光染色法对PKD进行检测的结果表明该细胞系具有良好的遗传稳定性。在相同培养条件下,PKD细胞的生长速度及形态与正常PK 15细胞无明显差异。用脂质体介导的方法,将PrVEa株基因组转染PKD细胞,在转染后30h细胞发生典型病变,表明PKD细胞对脂质体的毒害具有耐受性。TCID50测定结果显示:PKD对PrVEa株增殖尽管有明显的抑制作用,但PrVEa株仍能在其上正常增殖。上述研究结果提示:所构建的细胞系PKD可用于构建PrVEa株gD基因缺失毒株,为PrVEa株gD基因缺失毒株的构建提供了必备的工具。 展开更多

关键词 PK D细胞 逆转录病毒介导 正常 细胞系 基因缺失 转基因细胞 Ea株 毒株 生长速度

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猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达

8

作者 郭东春 钱平 +4 位作者 李祥敏 徐卓菲 姚清侠 金梅林 陈焕春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期6-9,共4页

参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1-6中分别扩增出NS2长1389 bp和876 bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴... 参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1-6中分别扩增出NS2长1389 bp和876 bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃,1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为40 ku处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带。Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,该表达产物主要存在于包涵体中。上述结果为NS2基因表达产物在免疫检测中的进一步应用奠定了基础。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 NS2基因 表达

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伪狂犬病毒诱导感染乳仔猪扁桃体淋巴细胞发生凋亡

9

作者 石德时 兰盛银 +3 位作者 李祥敏 金梅林 徐珍秀 陈焕春 《电子显微学报》 CAS CSCD 2005年第5期533-536,共4页

将伪狂犬病毒Ea株,按100 TCID50的剂量感染15日龄的健康乳仔猪,所有实验组仔猪在接种后5～7天出现伪狂病症状,取感染组及对照组仔猪扁桃体,进行透射电镜观察、原位末端脱氧核苷酸标记等试验.透射电镜观察发现扁桃体的淋巴细胞发生凋亡,... 将伪狂犬病毒Ea株,按100 TCID50的剂量感染15日龄的健康乳仔猪,所有实验组仔猪在接种后5～7天出现伪狂病症状,取感染组及对照组仔猪扁桃体,进行透射电镜观察、原位末端脱氧核苷酸标记等试验.透射电镜观察发现扁桃体的淋巴细胞发生凋亡,DNA原位末端脱氧核苷酸标记(TUNEL)呈阳性. 展开更多

关键词 PRV Ea株 电镜 细胞凋亡 乳仔猪 TUNEL

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伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达

10

作者 薛念波 肖少波 +6 位作者 江云波 梅小伟 刘曼莉 赵骞 罗锐 陈焕春 方六荣 《动物医学进展》 CSCD 2007年第12期1-5,共5页

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸。将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,... 以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定。序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸。将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应。根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 UL6基因 序列分析 表达

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H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

11

作者 但汉并 刘芳芳 +1 位作者 黄红亮 金梅林 《动物医学进展》 CSCD 2006年第8期67-69,共3页

以禽流感病毒A／Chicken／Hubei／327／2004（H5N1）免疫Balb／c小鼠，将免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验筛选细胞培养上清，采用有限稀释法对阳性孔进行克隆，3次克隆后获得7株能稳定分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝... 以禽流感病毒A／Chicken／Hubei／327／2004（H5N1）免疫Balb／c小鼠，将免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验筛选细胞培养上清，采用有限稀释法对阳性孔进行克隆，3次克隆后获得7株能稳定分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1C4，1D4，1E12，2E11，4C12，4G2和5E12。细胞培养上清HI效价为2^4～2^7，腹水HI效价可达2^10～2^18。所有单抗与禽流感H7和H9亚型标准血凝抗原，新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒无交叉反应。在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价，获得的单克隆抗体可在禽流感流行病学的监测中发挥重要作用。 展开更多

关键词 禽流感病毒 血凝素 单克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析 被引量：2

12

作者 马朝志 肖少波 +3 位作者 宁娟 江云波 方六荣 陈焕春 《动物医学进展》 CSCD 2007年第6期1-4,共4页

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株（VR-2332）基因序列，设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物。利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段，将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应... 根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株（VR-2332）基因序列，设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物。利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段，将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应用DNAMan软件，将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株（VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV）的相应基因进行序列比较，并绘制系统进化树。结果表明，PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83．6％～99．79／6，与LV株的相应基因核苷酸同源性为38．9％～49％；推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86．6％～99．6％，与LV株的同源性为54．2％～78．2％。系统进化树表明，PRRSV HS株属于美洲型，与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 结构蛋白基因 RT—PCR 序列分析

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猪传染性胸膜肺炎新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究 被引量：12

13

作者 刘建杰 陈焕春 +4 位作者 何启盖 吴斌 李冲 徐晓娟 陈汉阳 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期177-180,共4页

利用大肠杆菌表达猪胸膜肺炎放线杆菌的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ,提取表达产物包涵体,再加入我国流行的猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌,和等量弗氏佐剂乳化后制成亚单位菌苗,免疫 BALB/c小鼠,间隔 2 周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒... 利用大肠杆菌表达猪胸膜肺炎放线杆菌的分泌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ,提取表达产物包涵体,再加入我国流行的猪胸膜肺炎放线杆菌7型菌,和等量弗氏佐剂乳化后制成亚单位菌苗,免疫 BALB/c小鼠,间隔 2 周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的ELISA抗体和7型菌的血凝抗体,第2 次免疫 2 周后用 5LD50的猪胸膜肺炎放线杆菌1型、7型菌株进行攻毒。结果发现第2次免疫后抗体水平显著升高,用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为83.3%和91.7%,从死亡小鼠的体内分离到了攻毒菌株,初步的动物试验表明此种新型亚单位菌苗对同型和异型的APP菌株具有较好的保护力,为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。 展开更多

关键词 亚单位 小鼠 免疫后 菌苗 保护力 加强免疫 大肠杆菌表达 猪胸膜肺炎放线杆菌 猪传染性胸膜肺炎 菌株

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伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断方法的建立及其应用 被引量：13

14

作者 唐勇 陈焕春 +5 位作者 覃雅丽 方兵兵 何启盖 金梅林 吴斌 刘正飞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期526-529,共4页

利用gG基因表达产物建立了gG-酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法,以该方法检测100份猪血清,结果表明该方法可显著区分gG基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪,且特异性强、敏感性高。临床应用表明,该方法结果与其它临床诊断结果符合率高... 利用gG基因表达产物建立了gG-酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法,以该方法检测100份猪血清,结果表明该方法可显著区分gG基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪,且特异性强、敏感性高。临床应用表明,该方法结果与其它临床诊断结果符合率高。以该方法在部分使用gG基因缺失疫苗的猪场做流行病学调查,共检测842份血清,检出242份阳性,阳性率为28.74%。 展开更多

关键词 猪 伪狂犬病 gG基因 ELISA 鉴别诊断 基因缺失苗 伪狂犬病毒

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猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验 被引量：12

15

作者 何启盖 王贵平 +5 位作者 刘军发 陈焕春 周汉华 刘正飞 刘梦元 吴斌 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期360-363,共4页

对从全国 30多个猪场送检的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪中 ,用PPLO培养基进行了胸膜肺炎放线杆菌的分离 ,对分离菌进行了PCR鉴定和生化鉴定 ,并测定了该菌的培养特性、致病性和对药物的敏感性。结果成功分离到了15株胸膜肺炎放线杆菌 ,... 对从全国 30多个猪场送检的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪中 ,用PPLO培养基进行了胸膜肺炎放线杆菌的分离 ,对分离菌进行了PCR鉴定和生化鉴定 ,并测定了该菌的培养特性、致病性和对药物的敏感性。结果成功分离到了15株胸膜肺炎放线杆菌 ,该菌对先锋霉素类和氯霉素较敏感。 展开更多

关键词 胸膜肺炎放线杆菌 分离鉴定 药敏试验

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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ^-/Amp^r突变株的构建 被引量：4

16

作者 贝为成 何启盖 +5 位作者 陈焕春 徐晓娟 洪文洲 肖少波 宋云峰 刘建杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期186-191,共6页

根据已发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清5型核苷酸序列设计并合成了一对引物,从自行分离的APP菌株PCR扩增apxⅡCA基因,将该片段与pBluescriptSK(+)载体连接,得到质粒pSK CA。另外,从质粒pIC neo中得到的Ampr基因经XbaⅠ酶切消化... 根据已发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清5型核苷酸序列设计并合成了一对引物,从自行分离的APP菌株PCR扩增apxⅡCA基因,将该片段与pBluescriptSK(+)载体连接,得到质粒pSK CA。另外,从质粒pIC neo中得到的Ampr基因经XbaⅠ酶切消化后,克隆到pSK CA中的XbaⅠ位点,获得了重组转移质粒pSK CAmpr。pSK CAmprDNA通过电转化导入亲本菌,电转化后的产物涂布于TM平板,可获得突变株。提取突变株和亲本菌基因组DNA,用PCR检测含有apxⅡC基因的胸膜肺炎放线杆菌染色体区域。从突变株基因组DNA扩增得到的一条PCRDNA片段比从亲本菌基因组DNA扩增得到的一条DNA片段大1 3kb,增大的片段与所插入的Ampr基因大小相符合。用合成的Ampr基因引物从突变株基因组DNA中也能扩增到一条1 3kb的特异性DNA片段。同时South ernblot鉴定有特异性带。这表明我们所构建的突变株是成功的。测定了突变株的遗传稳定性及突变株对动物的安全性,为进一步研究用其它报告基因置换Ampr基因后,研制单基因工程疫苗及以APP毒力缺失突变菌株为载体,表达外源基因的APP基因工程菌的研究奠定了坚实的基础。 展开更多

关键词 猪 传染性胸膜肺炎 放线杆菌 apxⅡ^-/Amp^r突变株 基因构建 基因工程疫苗

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猪水肿病发病机理研究进展 被引量：18

17

作者 林艺远 刘国平 +1 位作者 杨明柳 吴斌 《动物医学进展》 CSCD 2006年第7期10-15,共6页

猪水肿病主要发生于断奶后2周内的仔猪,是常见的一种急性致死性传染病。该病是由利用其菌毛(F18ab)黏附于小肠上皮细胞,并产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)的产类志贺毒素大肠埃希菌引起的一种肠毒血症。仔猪断奶后的免疫能力,营养... 猪水肿病主要发生于断奶后2周内的仔猪,是常见的一种急性致死性传染病。该病是由利用其菌毛(F18ab)黏附于小肠上皮细胞,并产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)的产类志贺毒素大肠埃希菌引起的一种肠毒血症。仔猪断奶后的免疫能力,营养水平和遗传抗性是导致猪水肿病的主要影响因素。文章着重阐述了猪水肿病的致病机理,为该病的预防和治疗提供重要的理论依据。 展开更多

关键词 猪水肿病 产类志贺毒素大肠埃希菌 致病机理

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增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP在大肠杆菌中的表达与纯化 被引量：2

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作者 牛传双 方六荣 +2 位作者 肖少波 张辉 陈焕春 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期489-491,共3页

增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP/V16 3A/S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白 ,将mut4EGFP基因插入原核表达载体 pTWIN1中 ,使之与几丁质结合域 (CBD) 内含肽 (intein)融合 ,获得原... 增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP/V16 3A/S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白 ,将mut4EGFP基因插入原核表达载体 pTWIN1中 ,使之与几丁质结合域 (CBD) 内含肽 (intein)融合 ,获得原核表达质粒 pTWIN M 4。将 pTWIN M 4转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS ,IPTG诱导后进行SDS PAGE电泳分析 ,结果显示 ,CBD intein mut4EGFP融合蛋白在BL2 1(DE3) plysS中获得高效表达并以可溶性蛋白的形式存在。进一步采用几丁质柱纯化系统对表达产物进行纯化 ,得到了高纯度的mut4EGFP。 展开更多

关键词 绿荧光蛋白 突变体mut4EGFP 表达 纯化

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猪维甲酸诱导基因Ⅰ的克隆及其在诱导Ⅰ型干扰素中的作用 被引量：1

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作者 王荡 方六荣 +3 位作者 梅小伟 谢立兰 陈焕春 肖少波 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期135-140,共6页

本研究旨在探讨猪维甲酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）的结构特征及其在I型干扰素信号通路中的作用。从猪外周血单核细胞中克隆猪RIG-Ⅰ全长cDNA,进一步构建猪RIG-Ⅰ全长及不同区域缺失突变体的真核表达载体,通过IFN-βⅠ、RF3和NF-κB的荧光素... 本研究旨在探讨猪维甲酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）的结构特征及其在I型干扰素信号通路中的作用。从猪外周血单核细胞中克隆猪RIG-Ⅰ全长cDNA,进一步构建猪RIG-Ⅰ全长及不同区域缺失突变体的真核表达载体,通过IFN-βⅠ、RF3和NF-κB的荧光素酶报告系统分析猪RIG-Ⅰ在诱导I型干扰素中的作用。结果表明,猪RIG-Ⅰ开放读码框全长为2 832 bp,编码943个氨基酸,与鸭嘴兽、大鼠、小鼠、猴、黑猩猩、人、马和牛RIG-Ⅰ相应序列的同源性为53.2%~83.2%。猪RIG-Ⅰ超表达能显著激活转录因子IRF3和NF-κB,并诱导IFN-β的产生。缺失猪RIG-Ⅰ的CARD区不仅不能激活下游信号,而且还负调控poly（Ⅰ：C）诱导IFN-β的能力。结果提示RIG-Ⅰ是猪天然免疫系统中的一个模式识别受体,在I型干扰素诱导的信号通路中具有重要作用。 展开更多

关键词 猪 RIG-Ⅰ 克隆 序列分析 干扰素 信号通路

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猪伪狂犬病和传染性胸膜肺炎混合感染 被引量：3

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作者 王贵平 何启盖 +5 位作者 刘军发 刘正飞 吴斌 陈焕春 石勇 冷光敏 《河北畜牧兽医》 2004年第7期J033-J034,共2页

关键词 猪 伪狂犬病 传染性胸膜肺炎 混合感染

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