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蜡样芽孢杆菌cytK和nhe毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法的建立及其评价
1
作者 杨继飞 潘蓓珍 +6 位作者 刘岩 周钰娇 杨建宇 张先宇 丁文博 李昊宇 孙丽媛 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第2期516-525,共10页
目的:采用聚合酶链式反应(PCR)和胶体金技术建立1种蜡样芽孢杆菌cytK和nhe2种毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法,并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。方法:采用煮沸法提取蜡样芽孢杆菌DNA,以蜡样芽孢杆菌细胞毒素cytK和... 目的:采用聚合酶链式反应(PCR)和胶体金技术建立1种蜡样芽孢杆菌cytK和nhe2种毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法,并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。方法:采用煮沸法提取蜡样芽孢杆菌DNA,以蜡样芽孢杆菌细胞毒素cytK和非溶血性肠毒素nhe为靶基因设计特异性引物,通过克隆转化鉴定PCR产物,确定胶体金标记链霉亲和素、质量控制线(C线)、cytK检测线(T_(1))和nhe检测线(T_(2))最佳标记量,组装核酸试纸条并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。结果:蜡样芽孢杆菌DNA浓度为248 mg·L^(-1),纯度为1.8~2.0;经克隆转化和测序比对,PCR产物与GenBank数据库中已登记的蜡样芽孢杆菌cytK和nhe相似性均为100%。在pH为7.0的条件下,每200μL胶体金溶液中链霉亲和素最佳标记量为6.0μL;质量控制线(C线)最佳标记量为2.00 g·L^(-1),cytK基因检测线(T1)最佳标记量为0.550 g·L^(-1),nhe基因检测线(T_(2))最佳标记量为0.2 g·L^(-1)。特异性检测,仅蜡样芽孢杆菌组显示阳性结果,试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌无交叉反应,与电泳结果一致;灵敏度检测,当双重核酸试纸条中蜡样芽孢杆菌DNA浓度降至10^(-2)mg·L^(-1)时,可观察到C线、T1线和T_(2)线3个条带,检测限为琼脂糖凝胶电泳(10^(-1)mg·L^(-1))的1/10;重复性检测,由不同实验室不同人员对试纸条进行验证,结果一致;稳定性检测,在第6、9和12个月进行试纸条稳定性验证,稳定性良好。结论:本研究建立的双重核酸试纸条法可以同时检测蜡样芽孢杆菌cytK和nhe毒素基因,灵敏度高,特异性强,可实现快速可视化检测。 展开更多
关键词 蜡样芽孢杆菌 cytK NHE 双重核酸试纸条
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碳青霉烯类和喹诺酮类双重耐药核酸胶体金试纸条快速检测方法的建立及试剂盒研制
2
作者 潘蓓珍 杨继飞 +4 位作者 王岳峰 刘岩 周钰娇 马玉贺 孙丽媛 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期2386-2390,2398,共6页
目的:建立双重核酸胶体金试纸条快速检测鲍曼不动杆菌(Ab)OXA和par C耐药基因的方法并研制试剂盒。方法:采用加热煮沸法提取Ab的DNA,根据NCBI选择Ab的OXA和par C基因序列作为靶基因片段,设计引物并分别用6-FAM、地高辛和生物素进行标记... 目的:建立双重核酸胶体金试纸条快速检测鲍曼不动杆菌(Ab)OXA和par C耐药基因的方法并研制试剂盒。方法:采用加热煮沸法提取Ab的DNA,根据NCBI选择Ab的OXA和par C基因序列作为靶基因片段,设计引物并分别用6-FAM、地高辛和生物素进行标记,研发耐药基因检测试剂,采用双重核酸胶体金试纸条实现快速、可视化检测。采用分子克隆、测序技术克隆阳性对照品评价试剂盒的特异性、灵敏度和稳定性。结果:水煮法提取的Ab DNA浓度和纯度较好。克隆测序后的质粒DNA与GenBank数据库中基因序列的同源性均为100%;试剂盒的特异性良好,仅Ab出现阳性,其他菌属等均为阴性;双重核酸胶体金试纸条中Ab的DNA浓度降到10-3ng/μl时仍出现红色线,与电泳的最低检测限10-2ng/μl相比,灵敏度高出10倍;试剂盒分别在第3、6和9个月进行检测,稳定性较好。结论:本研究建立的Ab双重耐药检测试剂盒可同时检测Ab的OXA和par C耐药基因,具有高灵敏度、强特异性、快速简便等优点,为临床Ab碳青霉烯类和喹诺酮类抗生素耐药检测提供了一种新型快速的检测方法。 展开更多
关键词 鲍曼不动杆菌 OXA par C 分子克隆 胶体金 核酸试纸条
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耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌生物膜形成与外排泵基因AdeABC表达的相关性研究
3
作者 潘蓓珍 刘岩 +3 位作者 宿建胜 杨继飞 姜菲菲 孙丽媛 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期898-902,共5页
目的 研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成,以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法 将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆... 目的 研究鲍曼不动杆菌的生物膜形成,以及浮游态和生物膜状态下对外排泵基因AdeABC的相对表达量作用于碳青霉烯类抗生素耐药机制的影响。方法 将菌株经药物敏感性试验分为碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)组和碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CSAB)组,采用结晶紫染色法检测两组生物膜形成能力;通过微量肉汤稀释法分别测定两组对亚胺培南的MIC、MBIC值,并计算MBIC/MIC的比值进一步比较分析生物膜菌和浮游菌的耐药性;同时提取CRAB组浮游态和生物膜态的RNA,通过RT-qPCR检测外排泵基因AdeABC相对表达量。结果 35株标本的生物膜阳性率为91.43%,其中CRAB组生物膜的阳性检出率为92%,生物膜阴性、弱阳性、阳性和强阳性分别占8%、48%、36%和8%。MBIC/MIC比值显示,形成生物膜后,鲍曼不动杆菌的耐药能力呈现不同程度的增加,CSAB组的耐药增加幅度以2倍的菌株最多;CRAB组的增加幅度以4倍的菌株最多。同时CRAB组RT-qPCR结果显示,生物膜较浮游态相比,外排泵基因adeA和adeB的相对表达量明显增高(P<0.01),外排泵基因adeC相对表达量则无差异(P>0.05)。结论 鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药与生物膜密切相关,且生物膜态的鲍曼不动杆菌较浮游态可促进外排泵基因AdeABC的表达从而增强碳青霉烯类抗生素的耐药性。 展开更多
关键词 鲍曼不动杆菌 亚胺培南 生物膜 外排泵
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LAMP联合CRISPR/Cas12a系统检测副溶血性弧菌tlh基因方法的建立及其评价
4
作者 周钰娇 杨继飞 +6 位作者 刘岩 丁文博 张先宇 杨建宇 高林然 赵云冬 孙丽媛 《吉林大学学报(医学版)》 2025年第5期1399-1406,共8页
目的:建立环介导等温扩增(LAMP)和簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白12a(Cas12a)(CRISPR/Cas12a)系统相结合的病原微生物快速检测方法,并评价其检测副溶血性弧菌(Vp)不耐热溶血毒素(tlh)基因的效果。方法:以Vp的tlh基... 目的:建立环介导等温扩增(LAMP)和簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白12a(Cas12a)(CRISPR/Cas12a)系统相结合的病原微生物快速检测方法,并评价其检测副溶血性弧菌(Vp)不耐热溶血毒素(tlh)基因的效果。方法:以Vp的tlh基因作为靶基因,设计LAMP引物和CRISPR RNA(crRNA),构建并优化LAMP-CRISPR检测体系各成分最佳浓度配比,以蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌为对照组,建立快速检测Vp tlh基因的LAMPCRISPR/Cas12a方法,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性和阳性符合率进行评价。结果:该方法能特异性检出Vp,蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均为阴性结果。Vp DNA提取浓度为190.67 mg·L^(-1)时吸光度(A)(260)/A(280)比值为1.84。在定量PCR(qPCR)仪37℃、80个循环、40 min反应条件下,LAMP-CRISPR/Cas12a体系中Cas12a蛋白和crRNA的浓度为50 nmol·L^(-1)时肉眼亮度及相对荧光强度峰高,检测Vp DNA浓度灵敏度可达10^(-6) mg·L^(-1);重复性试验表明,不同实验人员在不同实验环境、不同时间重复检测结果一致。结论:建立的LAMP-CRISPR/Cas12a方法可以快速检测Vp的tlh基因,其灵敏度高、特异度强,可实现现场短时间的可视化检测。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 CRISPR-Cas12a系统 tlh基因 环介导等温扩增 核酸检测
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