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多重耐药铜绿假单胞菌群体感应相关基因表达及其对生物膜形成和耐药性的影响
1
作者 刘岩 潘蓓珍 +4 位作者 杨继飞 张先宇 丁文博 宋伶俐 赵云冬 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第4期921-928,共8页
目的:探讨临床多重耐药铜绿假单胞菌群体感应相关基因表达对生物膜形成和耐药性的影响,阐明耐药性增加的机制。方法:收集77株铜绿假单胞菌,根据其耐药性将菌株分为多重耐药组和敏感组,微孔板法构建生物膜筛选最佳形成条件,采用光学显微... 目的:探讨临床多重耐药铜绿假单胞菌群体感应相关基因表达对生物膜形成和耐药性的影响,阐明耐药性增加的机制。方法:收集77株铜绿假单胞菌,根据其耐药性将菌株分为多重耐药组和敏感组,微孔板法构建生物膜筛选最佳形成条件,采用光学显微镜观察2组铜绿假单胞菌生物膜形成情况,结晶紫染色半定量法检测2组铜绿假单胞菌生物膜形成能力,微量肉汤稀释法检测2组铜绿假单胞菌对群体感应抑制剂呋喃酮(C-30)的最低抑菌浓度(MIC)值,试剂盒法提取2组铜绿假单胞菌的RNA,改良TRIzol法提取2组铜绿假单胞菌中多重耐药组浮游态和生物膜态RNA,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组以及加入C-30抑制剂前后铜绿假单胞菌中lasR/I、RhlR/I和PqsR/A mRNA表达水平。结果:77株铜绿假单胞菌标本中有56株多重耐药株(多重耐药组),21株全敏感株(敏感组)。构建生物膜最佳条件,当铜绿假单胞菌浓度为1.5×10^(8)CFU·mL^(-1)、培养时间为48 h时生物膜形成量最多;77株铜绿假单胞菌标本的生物膜阳性率为91%,其中生物膜强阳性、中等阳性、弱阳性和阴性分别占16%、34%、41%及9%,多重耐药株的生物膜阳性率为96%,且多重耐药组的生物膜形成能力高于敏感组(P<0.05)。当群体感应抑制剂C-30的浓度为8 mg·L^(-1)时,可抑制多数铜绿假单胞菌生物膜的形成,且浓度越高,抑制作用越明显;浮游态RNA和生物膜态RNA的吸光度(A)值在1.8~2.0。RT-qPCR法,与浮游态比较,生物膜态的铜绿假单胞菌重群体感应相关基因lasR/I、RhlR/I和PqsR/A mRNA表达水平升高(P<0.01);与未加抑制剂组比较,加入抑制剂组铜绿假单胞菌中生物膜态的群体感应相关基因lasR/I、RhlR/I和PqsR/A mRNA表达水平降低(P<0.01)。结论:多重耐药铜绿假单胞菌的群体感应相关基因高表达会促进生物膜的形成,从而导致耐药性增加。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 生物膜 群体感应系统 实时荧光定量PCR 耐药性
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双重核酸纸条快速检测单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly毒素基因
2
作者 刘岩 杨建宇 +6 位作者 周钰娇 丁文博 张先宇 高林然 潘蓓珍 杨继飞 赵云冬 《南方医科大学学报》 北大核心 2025年第2期387-394,共8页
目的基于聚合酶链反应和胶体金技术相结合的双重核酸试纸条方法快速检测单核细胞增生李斯特菌prfA和hly两种毒素基因。方法采用加热煮沸法提取单核细胞增生李斯特菌DNA,以单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly为靶基因,分别用6-FAM标记prfA... 目的基于聚合酶链反应和胶体金技术相结合的双重核酸试纸条方法快速检测单核细胞增生李斯特菌prfA和hly两种毒素基因。方法采用加热煮沸法提取单核细胞增生李斯特菌DNA,以单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly为靶基因,分别用6-FAM标记prfA上游引物5'端,Biotin标记prfA下游引物5'端,Digoxin标记hly上游引物5'端和Biotin标记hly下游引物5'端,建立单核细胞增生李斯特菌的毒素基因检测方法,通过克隆转化、测序分析,克隆阳性对照品,研发试剂盒并对试剂盒特异性、灵敏度、复现性及稳定性进行评价,并通过样品检测对试剂盒进行验证。结果水煮法提取的单核细胞增生李斯特菌浓度为148.81±0.97ng/μL,A_(260)/A_(280)在1.8~2.0范围内;PCR产物经克隆转化、测序对比,与GenBank数据库中基因序列的同源性均为100%;特异性检测,仅单核细胞增生李斯特菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、蜡样芽胞杆菌无交叉反应;灵敏度检测,最低检测限为10^(-2)ng/μL,比琼脂糖凝胶电泳高10倍;复现性检测,不同实验室不同人员分别对核酸试纸条进行验证,结果一致;稳定性检测,在第6、9、12月对核酸试纸条进行验证,稳定性较好。样品检测结果显示,本试剂盒可准确快速的检出样品中单核细胞增生李斯特菌。结论本剂盒可同时检测单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly毒素基因,具有特异性强、灵敏度高、复现性好、稳定性好等优点,对保障食品安全具有现实意义。 展开更多
关键词 单核细胞增生李斯特菌 prfA hly 双重核酸试纸条
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基于杂合肽H5LL活性的生物信息学分析和重组乳酸菌表达载体的构建 被引量：1
3
作者 赵潇颖 宿建胜 +3 位作者 马嘉辉 王岳峰 王丹 孙丽媛 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1366-1374,共9页
目的:以人源性抗菌肽(AMPs)富组蛋白5 (Hst5)和LL-37为亲本,设计新型杂合肽H5LL,并通过基因工程技术构建重组乳酸菌表达载体,实现AMPs的高效和安全表达。方法:采用生物信息学方法对H5LL进行理化参数、亲/疏水性、剪切位点、磷酸化位点... 目的:以人源性抗菌肽(AMPs)富组蛋白5 (Hst5)和LL-37为亲本,设计新型杂合肽H5LL,并通过基因工程技术构建重组乳酸菌表达载体,实现AMPs的高效和安全表达。方法:采用生物信息学方法对H5LL进行理化参数、亲/疏水性、剪切位点、磷酸化位点、信号肽、跨膜区域、亚细胞定位和二级结构预测;将目的序列和空载质粒pMG36e经HindⅢ及KpnⅠ双酶切后,构建乳酸菌重组表达载体pMG36e-H5LL,克隆转化获得含目的基因的重组质粒。结果:H5LL成为AMPs的可能性较高,含36个氨基酸,相对分子质量为4 625 380,总电荷数为+10,具有亲水性;有3个磷酸化位点,无糖基化位点;属于膜内蛋白,无跨膜区域,无信号肽;亚细胞定位预测,线粒体靶向肽的可能性为0.333。二级结构中α-螺旋结构和β-转角占比分别52.78%及22.22%,三级结构中α-螺旋数量较多。含目的基因的重组质粒PCR电泳,于138 bp处有单一特异性条带;双酶切电泳,重组质粒在136和3 500 bp处有清晰条带。结论:设计并合成的新型杂合肽H5LL具有较高稳定性、抑菌活性和低毒性;成功构建重组乳酸菌表达载体pMG36e-H5LL。 展开更多
关键词 富组蛋白5 抗菌肽 生物信息学 乳酸菌 表达载体
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