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表面表达PD-L1纳米抗体的细菌外膜囊泡的生物学特性及其对PD-1/PD-L1信号通路的阻断作用
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作者 李智敏 霍明歌 +5 位作者 管龙雪 顾凡林 梁丹丹 刘倬睿 王国庆 关新刚 《吉林大学学报(医学版)》 2025年第5期1407-1414,共8页
目的:制备表面表达程序性细胞死亡配体1(PD-L1)纳米抗体的细菌外膜囊泡(OMV),探讨其结构特性、细胞相容性、细胞内分布及其对程序性细胞死亡受体1(PD-1)/PD-L1信号轴的阻断效果。方法:构建pET28a-ClyA-PD-L1nb原核表达载体,转化至大肠杆... 目的:制备表面表达程序性细胞死亡配体1(PD-L1)纳米抗体的细菌外膜囊泡(OMV),探讨其结构特性、细胞相容性、细胞内分布及其对程序性细胞死亡受体1(PD-1)/PD-L1信号轴的阻断效果。方法:构建pET28a-ClyA-PD-L1nb原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过超速离心法从转化PD-L1nb表达载体的BL21(DE3)单克隆菌落中分离OMV,利用组氨酸(His)标签进行蛋白纯化。采用透射电子显微镜和纳米粒径分析仪对OMV进行分析鉴定。将转化PD-L1nb表达载体的BL21(DE3)单克隆菌落所分离的OMV作为实验组,以未转化的BL21(DE3)单克隆菌落所分离的OMV作为对照组,采用Western blotting法检测2组OMV中ClyA-PDL1nb融合蛋白表达情况,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测OMV处理后小鼠巨噬细胞RAW264.7、小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1和人胚胎肾细胞HEK293T活性,应用荧光成像技术观察OMV的肿瘤细胞内吞情况,采用流式细胞术检测PBS组、OMV-PD-L1nb组和aPD-L1+OMV-PDL1nb组OMV与肿瘤细胞表面PD-L1的结合效果。结果:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),大肠杆菌诱导后在预计相对分子质量(约49000)附近出现明显加粗的蛋白条带,ClyA-PD-L1nb蛋白成功表达,纯化后泳道中无明显杂蛋白存在。利用超速离心法分离得到尺寸约120 nm的OMV-PD-L1nb,透射电子显微镜下呈现为尺寸均一的圆球形结构。Western blotting法,实验组OMV中检测到ClyA-PD-L1nb特异性条带。CCK-8法,经不同浓度OMV处理后,RAW 264.7细胞、4T1细胞和HEK293T细胞活性均接近100%。荧光成像,OMV-PD-L1nb被4T1细胞内吞后分散在细胞质中。与OMV-PD-L1nb组比较,aPD-L1+OMV-PD-L1nb组细胞中平均荧光强度明显降低(P<0.001)。结论:成功制备并分离了表面表达PD-L1nb的OMV即OMV-PD-L1nb,其在小鼠巨噬细胞、肿瘤细胞和人胚胎肾细胞上显示出良好的相容性,可被肿瘤细胞内吞并成功阻断PD-1/PD-L1信号通路。 展开更多
关键词 细菌外膜囊泡 程序性细胞死亡受体1 程序性细胞死亡配体1 纳米抗体 免疫检查点阻断
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纳米药物PTX_(2)NPs的制备及其对人肺癌A549细胞的杀伤作用
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作者 薛晗 范宇鑫 +3 位作者 张婷 李智敏 霍明歌 关新刚 《吉林大学学报(医学版)》 2025年第5期1260-1266,共7页
目的:利用嵌段共聚物二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)制备包裹紫杉醇二聚体(PTX_(2))的纳米药物PTX_(2)纳米粒子(NPs),即PTX_(2)NPs,探讨PTX_(2)NPs对人肺癌A549细胞的杀伤效果及其对细胞凋亡的影响。方法:利用纳米... 目的:利用嵌段共聚物二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)制备包裹紫杉醇二聚体(PTX_(2))的纳米药物PTX_(2)纳米粒子(NPs),即PTX_(2)NPs,探讨PTX_(2)NPs对人肺癌A549细胞的杀伤效果及其对细胞凋亡的影响。方法:利用纳米沉淀法制备PTX_(2)NPs,采用动态光散射法(DLS)检测其粒径分布,透射电子显微镜(TEM)观察PTX_(2)NPs的超微结构。在0和10 mol·L^(-1)二硫苏糖醇(DTT)处理后,采用透析法检测PTX_(2)NPs体外释放情况。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测不同浓度PTX_(2)和PTX_(2)NPs(0.0001、0.0010、0.0100、0.1000和1.0000μmol·L^(-1))处理后各组A549细胞存活率。将A549细胞分为对照组、PTX_(2)和PTX_(2)NPs组,采用细胞活/死染色法检测各组A549细胞生存情况,流式细胞术检测各组人肺癌A549细胞凋亡率。结果:DLS检测,PTX_(2)NPs粒径为144.7 nm,TEM下呈均一圆球结构;PTX_(2)NPs能够在还原环境中持续释放紫杉醇(PTX),72 h累积释放率约为84%。CCK-8法,PTX_(2)和PTX_(2)NPs均抑制A549细胞增殖且呈剂量依赖性。在PTX浓度<0.01μmol·L^(-1)时,与PTX_(2)组比较,PTX_(2)NPs组A549细胞存活率明显降低(P<0.01或P<0.001)。活/死细胞染色法,与PTX_(2)组比较,PTX_(2)NPs组红色荧光标记的死细胞数量增加。流式细胞术,与对照组和PTX_(2)组比较,PTX_(2)NPs组A549细胞凋亡率明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:成功制备包裹PTX_(2)的纳米药物PTX_(2)NPs,能够响应性释放PTX,对人肺癌A549细胞具有较PTX_(2)更明显的杀伤作用。 展开更多
关键词 紫杉醇二聚体 纳米粒子 肺腺癌 药物递送 细胞凋亡
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