目的建立蛋白酶K结合磁珠免疫沉淀提取贝类中甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的方法,并与国际标准方法(ISO15216—2017)进行比较研究。方法应用高效价的HAV单克隆抗体,采用偶联技术,通过优化参数,建立蛋白酶K结合磁珠免疫沉淀的提...目的建立蛋白酶K结合磁珠免疫沉淀提取贝类中甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的方法,并与国际标准方法(ISO15216—2017)进行比较研究。方法应用高效价的HAV单克隆抗体,采用偶联技术,通过优化参数,建立蛋白酶K结合磁珠免疫沉淀的提取方法;通过人工预加入103~105 CCID50/mL的4种甲型肝炎活病毒,计算回收率和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD),评价方法的提取效果;通过对来自5个产地的4种贝类进行病毒提取和一步法实时荧光定量逆转录PCR(quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chainreaction,qRT-PCR)检测,评价方法的适用性。结果HAV单抗效价为1×107,纯度为94.36%,与戊型肝炎病毒、乙型肝炎病毒以及同为小RNA病毒的柯萨奇病毒A16型和肠道病毒A71型均无交叉反应,特异性良好。贝类样品中HAV的平均回收率为22.02%,RSD为0.67%~5.87%,表明该方法对HAV是有效的。与国际标准提取方法相比,在不同浓度下可将HAV检测拷贝数提高10倍以上,显示出良好的剂量效应关系,并且可将不同产地间、不同品种贝类间的检测RSD从4.31%~44.75%和0.61%~29.10%,分别降低至1.76%~6.90%和0.63%~4.80%,有效降低贝类组织中干扰成分的影响。结论该方法较国际标准方法回收率高、抗干扰能力强,具有良好的重现性,提高了贝类等食品中HAV检测灵敏度、可靠性,为贝类等食品安全检测提供了关键的提取手段。展开更多
