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差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究 被引量:10
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作者 辛毅 刘小希 +6 位作者 赵伟 刘飒 李娜 许秀芳 黄益民 罗毅 张宏家 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期746-753,共8页
本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)和内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连... 本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)和内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连蛋白包被并结合EGM-2MV培养基分别扩增MSC和EPC。用台盼蓝法测定细胞传代成活率,通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测MSC和EPC的增殖能力及诱导分化成骨细胞、成脂肪细胞能力,并结合流式细胞术(FCM)检测MSC免疫原型以鉴定MSC;细胞吞噬功能特异性地摄取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并结合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光鉴定EPC,并计算其纯度。结果表明,经密度梯度分离单个核细胞,在早期贴壁细胞24 h换液时即可见明显集落形成,8 d后达80%融合,细胞呈均匀一致的长梭形排列;2次贴壁细胞经EGM-2MV培养基培养,第3天开始伸展,约8 d可融合近80%,细胞呈多角形,出现条索状结构;2种细胞台盼蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上,传至第2代后,生长曲线均近似"S"形;MTT法检测显示,细胞生长d 3至d 5时光密度值变化较明显;MSC G0-G1期为(93.32±1.65)%、EPC G0-G1为(93.05±1.95)%,2种细胞DNA周期无明显差异;早期贴壁细胞FCM检测CD90、CD44阳性率为(99.7±1.12)%、(99.1±2.33)%;CD14、CD45、CD79a阳性率分别为(4.8±0.38)%、(6.8±0.49)%及(0.4±0.08)%,经体外诱导能够向成骨细胞及脂肪细胞分化,鉴定为MSC;2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(82.1±3.4)%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为(74.2±3.2)%、(64.7±4.3)%及(43.5±1.5)%,鉴定为EPC。结论:应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的MSC,2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的EPC,为组织工程学研究提供种子细胞。 展开更多
关键词 差速贴壁法 骨髓 间充质干细胞 内皮祖细胞 细胞培养 生物学特性
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小鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养及生物学特性 被引量:7
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作者 辛毅 许秀芳 +3 位作者 黄益民 张颖 李温斌 李娜 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期565-570,共6页
目的:探讨一种高效、稳定的从小鼠心肌组织中分离培养心肌微血管内皮细胞的方法并观察细胞的生物学特性。方法:以多聚赖氨酸对培养皿作预包被,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁分离法,结合内皮细胞专用培养基,分离培养微血管内皮细胞并进... 目的:探讨一种高效、稳定的从小鼠心肌组织中分离培养心肌微血管内皮细胞的方法并观察细胞的生物学特性。方法:以多聚赖氨酸对培养皿作预包被,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁分离法,结合内皮细胞专用培养基,分离培养微血管内皮细胞并进行扩增。利用倒置显微镜观察细胞生长情况;台盼蓝法、绘制生长曲线和MTT法分别测定心肌微血管内皮细胞传代成活率、不同代生长及增殖特征;以DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双标,结合CD31、vWF和CD34免疫荧光鉴定细胞表面特异性抗原;体外血管形成实验检测心肌微血管内皮细胞的功能。结果:酶消化、差速贴壁法分离培养2 d后,细胞呈散在的、小簇状聚集性生长,4~5 d迅速生长呈单层排列,细胞为梭形、三角形或多角形,7~8 d后呈铺路石样即可传代;传代细胞经台盼蓝法检测成活率均为95%以上;第1、3代细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示第1、3代细胞在第2~4 d吸光度变化较明显(P<0.05);随传代次数的增加,第5代细胞生长曲线近似平缓,吸光度无明显变化,细胞逐渐衰老;DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双标阳性率为(89.2±3.5)%,相关特异性抗原CD31、vWF和CD34免疫荧光鉴定阳性率为(56.7±3.7)%、(78.5±2.6)%和(67.8±4.2)%;体外血管形成实验显示,6~12 h后出现明显的管腔结构。结论:以多聚赖氨酸作预包被,采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁法并结合内皮细胞专用培养基,可获得纯度较高的小鼠心肌微血管内皮细胞,为心脏疾病的研究提供种子细胞。 展开更多
关键词 心肌微血管内皮细胞 原代细胞培养 生物学特性 小鼠
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成年小鼠心成纤维细胞的原代培养及生物学特性 被引量:3
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作者 辛毅 刘飒 +4 位作者 许秀芳 李温斌 黄益民 罗毅 周玉杰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1194-1199,共6页
目的:建立适用于成年小鼠心成纤维细胞的体外分离培养及鉴定的技术方法。方法:应用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及组织贴块法两种方法对小鼠心成纤维细胞进行体外培养。在倒置显微镜下观察心成纤维细胞生长情况;台盼蓝法测定细胞传... 目的:建立适用于成年小鼠心成纤维细胞的体外分离培养及鉴定的技术方法。方法:应用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及组织贴块法两种方法对小鼠心成纤维细胞进行体外培养。在倒置显微镜下观察心成纤维细胞生长情况;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种方法获得的心成纤维细胞的增殖情况;观察不同培养基对心成纤维细胞生长的影响;苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态,采用免疫荧光染色观察培养细胞波形蛋白、纤维连结蛋白及盘状结构域受体2(DDR2)的表达。结果:酶联合消化法分离培养的细胞1 d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3 d后生长迅速呈长梭形;贴块法培养的细胞4 d后,可见细胞从组织块边缘长出,7 d后细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为97%。两种方法获得的第3代细胞生长曲线近似"S"形、MTT法显示3~5 d细胞增殖较明显;酶联合消化法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为62.61%和30.87%,组织贴块法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为69.24%和28.05%;含100 mL/L胎牛血清的HG/DMEM培养基培养的细胞出现明显对数期。两种方法培养的第3代细胞行苏木素-伊红染色可见细胞漩涡状排列,免疫荧光检测波形蛋白、纤维连接蛋白及盘状结构域受体2表达阳性。结论:两种方法均可高效获得心成纤维细胞在体外稳定培养。与贴块法培养相比较,利用联合酶消化法能较有效的获得波形蛋白、纤维连结蛋白、DDR2高表达阳性的心成纤维细胞。 展开更多
关键词 成年小鼠 心成纤维细胞 分离和原代培养 生物学鉴定
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人脐带间充质干细胞的原代培养及多向分化潜能的研究 被引量:11
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作者 辛毅 李娜 +4 位作者 黄益民 崔巍 刘飒 许秀芳 张兆光 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1087-1093,共7页
目的探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)的体外分离培养鉴定方法及多向分化潜能。方法应用Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法及组织贴块培养法对hUCMSC进行体外培养。在倒置显微镜下观察不同方法获得的hUCMSC的生长特点;台盼蓝法测定细... 目的探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)的体外分离培养鉴定方法及多向分化潜能。方法应用Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法及组织贴块培养法对hUCMSC进行体外培养。在倒置显微镜下观察不同方法获得的hUCMSC的生长特点;台盼蓝法测定细胞传代成活率;采用生长曲线、MTT法测定hUCMSC的增殖、流式细胞术(FCM)测定细胞周期变化及细胞免疫表型变化;采用相应试剂盒鉴定其向成脂细胞、成骨细胞的分化,采用免疫荧光细胞化学技术检测向成心肌样细胞的分化、采用荧光标记技术检测hUCMSC向血管内皮细胞的分化。结果酶消化法分离培养的细胞1d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈圆形生长,4d后生长迅速呈长梭形,7d后由中心向周围生长且增殖明显,10d后达80%融合即可传代;贴块法培养的细胞7d后,可见细胞从组织块边缘长出,10d后细胞数量逐渐增多,16d后细胞生长迅速呈单层致密排列即可传代,细胞传代成活率均为96%以上。2种方法获得的第3代细胞生长曲线近似“S”形、MTr法显示3~5d细胞增殖较明显;酶消化法培养的细胞G0/G1期和s+G2/M期所占比例分别为88.78%和10.21%,组织贴块法培养的细胞G0/G1期和S+G2/M期所占比例分别为84.82%和13.87%,细胞DNA周期无明显差异;2种方法获得的细胞经FCM检测CD90、CD105、CD73阳性率均为99%以上为高表达;CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA—DR低表达;2种方法获得的细胞在体外诱导都能向成骨细胞、成脂细胞、成心肌样细胞及血管内皮细胞分化,其诱导阳性率均为90%以上。结论酶消化法和贴块法均可高效获得hUCMSC,与贴块法培养相比较,酶消化法能更有效的获得扩增迅速、细胞成分单一的细胞。 展开更多
关键词 人脐带间充质干细胞 原代培养 诱导分化
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绿色荧光蛋白转基因小鼠不同源性间充质干细胞原代培养及生物学特性比较 被引量:1
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作者 辛毅 李娜 +4 位作者 张颖 黄益民 刘飒 许秀芳 张兆光 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期1141-1147,共7页
目的:探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞( MSCs )的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法:应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显... 目的:探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞( MSCs )的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法:应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察2种细胞的生长特点,运用生长曲线和MTT法检测其原代细胞增殖能力,台盼蓝法测定细胞传代成活率,采用流式细胞术测定2种第3代( P3)细胞DNA周期及表面标志物的表达,并比较其向成脂细胞和成骨细胞的分化潜能。结果:酶消化法分离培养的脐带MSCs 1 d后,细胞贴壁呈成纤维形,2 d后呈漩涡状生长且增殖明显,3 d后达80%融合即可传代;应用密度梯度离心法分离骨髓MSCs,体外培养4 d后,细胞贴壁呈圆形、梭形和多角形生长,5 d后呈克隆样生长且增殖明显,7 d后达80%融合即可传代。原代培养的脐带MSCs生长曲线近似“S”形,骨髓MSCs 生长曲线较平缓;MTT法显示脐带MSCs在3~5 d增殖较明显,骨髓MSCs 7 d后细胞增殖较明显。2种P3细胞传代成活率均为96%以上,G0/G1期细胞均为85%以上,无明显差异(P>0.05);2种P3细胞CD44、CD90和CD105阳性率均为(60.7±2.3)%以上高表达,CD45、CD19、CD14和CD79a均为(25.6±4.8)%低表达,两者无明显差异( P>0.05);2种MSCs在体外均具有向成骨细胞和成脂细胞分化的潜能,脐带MSCs向成骨及成脂细胞分化率均为90%以上,与骨髓MSCs的分化潜能比较有显著差异( P<0.05)。结论:脐带MSCs较骨髓MSCs具有较强的增殖能力及分化潜能。绿色荧光蛋白转基因小鼠的脐带MSCs可作为较好干细胞示踪的细胞源。 展开更多
关键词 脐带 骨髓 间充质干细胞 生物学特性 绿色荧光蛋白 转基因小鼠
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心脏移植后PBMC表面蛋白分子的表达与组织病理学改变的比较 被引量:1
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作者 顾云 黄益民 +3 位作者 孟旭 白涛 李玉梅 辛毅 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期760-762,共3页
目的: 比较心脏移植前后,外周血单个核细胞(PBMC)表面蛋白分子的表达与组织病理学改变时相间的差别,探讨免疫分子的活性变化与移植器官排斥反应时间进程间的关系.方法: 6例心脏移植患者于术前、术后不同时间点取外周血,用不同荧光单克... 目的: 比较心脏移植前后,外周血单个核细胞(PBMC)表面蛋白分子的表达与组织病理学改变时相间的差别,探讨免疫分子的活性变化与移植器官排斥反应时间进程间的关系.方法: 6例心脏移植患者于术前、术后不同时间点取外周血,用不同荧光单克隆抗体(mAb)标记PBMC表面的蛋白分子后,用流式细胞仪检测MHC-II、CD3、CD4、CD8、HLA-DR和ICAM-I的表达.常规移植术后供心组织病理检查, 根据国际器官移植排斥反应的病理诊断标准分级.结果: (1)6例实施心脏移植的患者中, 有3例在不同时间发生不同程度的急性排斥反应.(2)发生排斥反应的病例在整个30 d的观测期内, CD3、CD4及CD8的表达水平, 均高于未发生排斥反应的病例.(3)发生移植排斥反应的患者,其PBMC上HLA-DR的表达于移植术后72 h出现高峰, 出现高峰的时间较用活组织检查诊断排斥反应的时间早4~7 d.(4)发生排斥反应的患者PBMC上MHC-II及ICAM-I的表达,分别于术后3 d及2 d 出现高于术前的表达峰,于术后15 d达峰值,峰值的出现时间与病理改变基本同步.结论: (1)心脏移植患者术前的免疫功能状况,与移植术后排斥反应的发生率及严重性有一定的相关性.(2)监测PBMC表面HLA-DR、MHC-II及ICAM-I分子的表达, 对临床早期发现心脏移植排斥反应具有一定的指导意义. 展开更多
关键词 心脏移植 急性排斥反应 外周血单个核细胞 免疫分子表达
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环孢霉素A对大鼠心脏移植模型淋巴细胞分子表达与移植心脏病理学改变时相关系的影响
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作者 许秀芳 辛毅 +5 位作者 李娜 张颖 黄益民 顾云 周玉杰 张兆光 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期161-169,共9页
【目的】通过环孢素A(CsA)干预的异体异位心脏移植动物模型的研究,对移植术后淋巴细胞分子表达、心肌组织淋巴细胞浸润能力和移植心脏病理改变时相进行比较,探讨环孢素A对其影响。【方法】SD大鼠为移植心脏供体,Wistar大鼠为移植心脏受... 【目的】通过环孢素A(CsA)干预的异体异位心脏移植动物模型的研究,对移植术后淋巴细胞分子表达、心肌组织淋巴细胞浸润能力和移植心脏病理改变时相进行比较,探讨环孢素A对其影响。【方法】SD大鼠为移植心脏供体,Wistar大鼠为移植心脏受体。实验分为心脏移植对照组和环孢素A干预+心脏移植组实验组两组。在移植前及移植后24 h、3 d、7d、10 d和12 d时间点免疫荧光测定淋巴细胞在心肌组织中浸润能力、实时定量PCR检测淋巴细胞编码基因CD4、CD8和酪氨酸激酶P59 mRNA表达水平、心肌组织病理学检查判断排斥反应程度。【结果】①心脏移植后24 h内,外周血淋巴细胞基因的转录与表达为一过性降低;②心肌组织CD4+、CD8+淋巴细胞浸润和Ⅱ级排斥反应病理改变,主要出现于心脏移植后的d3~d7;③环孢素A不能有效抑制移植后3 d内心肌组织CD4+、CD8+淋巴细胞浸润程度的快速增加,但可明显降低移植后d3~d7的心肌组织CD4+淋巴细胞的浸润程度;④环孢素A不能完全阻断淋巴细胞P59基因的表达;⑤环孢素A不能有效抑制淋巴细胞CD4基因正调表达,但可抑制CD8基因的转录。【结论】环孢素A的移植排斥反应的抑制作用在大鼠移植后d3~d7。淋巴细胞基因表达、心肌组织淋巴细胞浸润与排斥反应病理改变有关。这将有助于同种移植病人环孢素A的临床应用。 展开更多
关键词 大鼠心脏移植模型 心脏外科 心肌组织淋巴细胞浸润 病理学 外周血淋巴细胞基因表达时相 免疫学
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参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 被引量:19
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作者 吴永涛 罗毅 +2 位作者 顾云 苏俊武 辛毅 《中国比较医学杂志》 CAS 2007年第1期26-29,I0002,共5页
目的探讨中成药参附注射液对在体结扎大鼠冠状动脉缺血-再灌注心肌损伤的效果以及作用机理。方法将46只SD大鼠随机分成5组,(1)非手术组;(2)结扎左冠状动脉前降支(LAD)引起心肌缺血30 min对照组1;(3)心肌缺血30 min给药组1;(4)心肌缺血/... 目的探讨中成药参附注射液对在体结扎大鼠冠状动脉缺血-再灌注心肌损伤的效果以及作用机理。方法将46只SD大鼠随机分成5组,(1)非手术组;(2)结扎左冠状动脉前降支(LAD)引起心肌缺血30 min对照组1;(3)心肌缺血30 min给药组1;(4)心肌缺血/再灌注10 min对照组2;和(5)心肌缺血/再灌注10 min给药组2。分别测定心肌组织匀浆丙二醛(MDA)含量,应用透射电镜观察心肌细胞超微结构改变,并对线粒体进行体视学分析,以及抗氧化基因超氧化物岐化酶1(SOD1)和谷胱苷肽S转移酶基因的表达。结果给药组与对照组同一时间点比较心肌组织MDA含量均有显著下降(P<0.05);超微结构显示参附明显减小心肌细胞组织结构以及线粒体的损害;体视学分析显示对照组较非手术组线粒体有显著变化(P<0.01),而两给药组较非手术组线粒体变化较小(P<0.05);参附上调SOD1和谷胱苷肽S转移酶基因的表达。结论参附注射液通过保护线粒体,减轻脂质过氧化的程度;还可通过上调SOD1及谷胱苷肽S转移酶等抗氧化基因,增加机体抗氧化能力抵抗缺血/再灌注时过氧化脂质损伤,保护心肌细胞。 展开更多
关键词 参附注射液 缺血-再灌注损伤 心肌保护
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大鼠心肌缺血/再灌注损伤基因表达谱特征的初步观察 被引量:1
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作者 刘艳霞 顾云 +3 位作者 吴永涛 辛毅 罗毅 黄益民 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期984-986,共3页
目的:观察心肌缺血/再灌注损伤前后基因差异表达,探讨缺血/再灌注后心肌细胞损伤的分子生物学机制。方法:提取大鼠缺血/再灌注前后心肌组织mRNA并纯化,用Affymetrix RAT 230A基因表达谱芯片,对表达差异基因进行检测。结果:按差异显著阳... 目的:观察心肌缺血/再灌注损伤前后基因差异表达,探讨缺血/再灌注后心肌细胞损伤的分子生物学机制。方法:提取大鼠缺血/再灌注前后心肌组织mRNA并纯化,用Affymetrix RAT 230A基因表达谱芯片,对表达差异基因进行检测。结果:按差异显著阳性标准,从14000个基因中筛选出缺血/再灌注后差异表达基因179条,其中123条表达上调,56条表达下调,包括原癌基因、细胞周期、信号转导、细胞外基质、细胞骨架蛋白、转录因子、DNA损伤修复基因、凋亡相关蛋白及核糖体蛋白等相关编码基因。结论:用cDNA表达谱芯片分析心肌缺血/再灌注后基因表达,能快速筛选出再灌注损伤相关基因,为临床上更有效地预防缺血/再灌注损伤提供根据。 展开更多
关键词 大鼠 基因表达 缺血/再灌注
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环孢素A、抗生素、硒对大鼠心肌组织中CD4^+/CD8^+淋巴细胞浸润的影响
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作者 林筝 戴燕红 +1 位作者 赵颂军 黄益民 《首都医科大学学报》 CAS 2002年第3期215-217,共3页
将同批Wistar大鼠分为对照、环孢素A、抗生素以及微量元素硒组 (每组各 6只 )。于给药 2 4h取心脏标本 ,冰冻切片 ,常规染色和CD4 + /CD8+ 单克隆荧光抗体免疫组化标记 ,于普通光学显微镜及荧光显微镜下对心肌组织中淋巴细胞进行计数和... 将同批Wistar大鼠分为对照、环孢素A、抗生素以及微量元素硒组 (每组各 6只 )。于给药 2 4h取心脏标本 ,冰冻切片 ,常规染色和CD4 + /CD8+ 单克隆荧光抗体免疫组化标记 ,于普通光学显微镜及荧光显微镜下对心肌组织中淋巴细胞进行计数和分类。常规染色片中 ,环孢素A组、抗生素和服硒组心肌组织中浸润的淋巴细胞总数均低于对照组 (P <0 .0 1 ) ;降低程度为环孢素A组 >服硒组 >抗生素组。免疫组化片中 ,环孢素A组和抗生素组心肌组织中浸润的CD4 + 和CD8+ 淋巴细胞数低于对照组。结果提示 :环孢素A、抗生素、微量元素硒均可抑制大鼠淋巴细胞对心肌组织的浸润 ,主要通过同时抑制CD4 + 和CD8+ 淋巴细胞在心肌组织中的浸润功能而起作用。 展开更多
关键词 环孢素A 抗生素 微量元素硒 淋巴细胞浸润
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