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老年性骨关节炎与类风湿关节炎滑膜细胞转化特性的比较研究
1
作者 张育军 曹争明 +5 位作者 丁孝权 黄越龙 董建强 张旗 吕厚山 孙铁铮 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期97-101,150,共6页
目的与骨关节炎比较,探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)胞外信号活化蛋白激酶(ERK)的活化状态和P53蛋白的异常表达。方法原代培养RA FLS和OA FLS,应用western blot检测二者... 目的与骨关节炎比较,探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)胞外信号活化蛋白激酶(ERK)的活化状态和P53蛋白的异常表达。方法原代培养RA FLS和OA FLS,应用western blot检测二者ERK活化状态的差异;应用抗P53抗体(DO-1和PAb240)与抗PCNA抗体对RA和OA的滑膜组织和细胞进行免疫组织化学染色;并进一步应用western blots确定RA FLS P53的异常表达。结果与OA相比,RA滑膜衬里层P53蛋白表达增多,主要为与抗突变型P53抗体阳性反应细胞积聚,并进一步证实RA衬里层成纤维样滑膜细胞P53表达异常;而且RA FLS在低血清和非贴壁情况下ERK活化状态均明显高于骨关节炎。结论类风湿关节炎衬里层成纤维样滑膜细胞P53蛋白异常表达,而且ERK处于持续活化状态,这为RAFLS的转化特性提供了新的佐证。 展开更多
关键词 骨关节炎 类风湿关节炎 滑膜细胞 转化
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miR-449b和miR-34c对卵巢癌细胞SKOV3-ipl周期相关蛋白的下调及细胞周期阻滞作用 被引量：7
2
作者 马丽萍 李娜 +1 位作者 何湘君 张旗 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期129-133,共5页
目的：基于miR-449和miR-34在p53突变的卵巢癌细胞系SKOV3和SKOV3-ipl的表达差异,研究探讨这些miRNA对肿瘤细胞生长、细胞周期的影响及靶基因的表达变化。方法：通过反转录实时定量PCR方法测定miR-449a/b和miR-34b,c在SKOV3和SKOV3-ipl... 目的：基于miR-449和miR-34在p53突变的卵巢癌细胞系SKOV3和SKOV3-ipl的表达差异,研究探讨这些miRNA对肿瘤细胞生长、细胞周期的影响及靶基因的表达变化。方法：通过反转录实时定量PCR方法测定miR-449a/b和miR-34b,c在SKOV3和SKOV3-ipl的表达,通过转染使它们在极低表达的SKOV3-ipl中获得表达。用MTS方法测定细胞生长率变化、流式细胞术检测细胞周期改变、Western blot检测细胞周期相关蛋白表达。结果：miR-449b和miR-34c使SKOV3-ipl黏附性下降28%~34%,细胞周期阻滞：G1期细胞数量分别增加15.62%和15.71%;S期细胞数量分别减少15.96%和16.56%。细胞周期相关蛋白CDK6和CDC25A均表达下调,miR-449b使CDK6减少39%、CDC25A减少22%;miR-34c使CDK6减少49%、CDC25A减少32%;而miR-449b与miR-34c共同作用后,下调作用更明显,CDK6减少69%,CDC25A减少86%,CyclinA减少59%。结论：miR-449b和miR-34c使高恶性卵巢癌细胞系SKOV3-ipl发生细胞周期阻滞,CDK6、CDC25A和CyclinA表达均下调。 展开更多
关键词 卵巢肿瘤 细胞周期蛋白类 微RNAS
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实时定量PCR阵列检测小鼠大脑组织microRNA表达谱 被引量：4
3
作者 张旗 何湘君 +2 位作者 刘玉京 马丽萍 潘秀英 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期152-157,共6页
目的:分析小鼠大脑组织microRNA(miRNA)表达谱,为研究特定miRNA及其靶基因、中枢神经系统miRNA相关的调节网络,以及miRNA在中枢神经系统疾病中的作用提供参考。方法:采用RNA加尾和引物延伸序列RT-PCR法,将精心设计的特异引物按Tm值排成... 目的:分析小鼠大脑组织microRNA(miRNA)表达谱,为研究特定miRNA及其靶基因、中枢神经系统miRNA相关的调节网络,以及miRNA在中枢神经系统疾病中的作用提供参考。方法:采用RNA加尾和引物延伸序列RT-PCR法,将精心设计的特异引物按Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增每一个miRNA,并计算出每种miRNA相对于内参的表达量。结果:共检测了285个miRNA,阳性者260个,它们丰度不同,频数分布图大致呈正态。大部分miRNA的表达水平与已发表的芯片结果一致,而阳性率高于芯片结果。源自同一miRNA前体的2个成熟miRNA表达量,有些相差无几,有些则相差甚多。同簇相邻miRNA的丰度有些相近,有些则差异明显,提示miRNA转录后的归宿决定其丰度。结论:采用实时定量PCR阵列法,分析了小鼠大脑组织的miRNA表达谱,特别是获得了一些低丰度miRNA在小鼠大脑中表达的数据,这将有助于对这些低丰度miRNA的功能研究。 展开更多
关键词 微RNAS 基因表达谱 逆转录聚合酶链反应 小鼠
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高迁移率蛋白A2在浆液性卵巢癌中高表达及其与let-7家族microRNA的关系 被引量：5
4
作者 杨静 张旗 +2 位作者 董建强 昌晓红 何湘君 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期749-754,共6页
目的:检测高迁移率蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)、let-7家族microRNA和P53在浆液性卵巢癌中的表达,分析HMGA2和let-7家族microRNA的关系,比较HMGA2与P53在浆液性卵巢癌中的表达情况。方法:用免疫组织化学方法检测50例卵巢癌和... 目的:检测高迁移率蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)、let-7家族microRNA和P53在浆液性卵巢癌中的表达,分析HMGA2和let-7家族microRNA的关系,比较HMGA2与P53在浆液性卵巢癌中的表达情况。方法:用免疫组织化学方法检测50例卵巢癌和4例正常输卵管石蜡包埋标本中HMGA2和P53蛋白的表达,采用实时荧光定量逆转录-PCR方法检测对应标本以及卵巢癌细胞系中HMGA2 mRNA和let-7家族microRNA的表达。结果:HMGA2和P53在浆液性卵巢癌中免疫组织化学染色阳性率分别为70%(35/50)和78%(39/50)。HMGA2在输卵管纤毛上皮中有微弱表达,在分泌型上皮细胞中不表达;HMGA2的表达存在随着肿瘤病理分级的增高而增高的趋势,但与肿瘤临床分期没有关系。HMGA2 mRNA在所有卵巢癌标本中均能检测到,但在72%(36/50)的标本中表达量高于正常输卵管组;恶性程度高的细胞系(SKOV3.ipl)比恶性程度低(SKOV3)的细胞系HMGA2 mRNA表达更高。let-7家族各成员在所有浆液性卵巢癌标本中均表达,其表达量与HMGA2 mRNA呈低度负相关(r=-0.305,P<0.05)。结论:HMGA2可能与P53一样,可以作为浆液性卵巢癌的生物标志物,其表达与浆液性卵巢癌恶性程度有关。let-7表达降低是HMGA2在浆液性卵巢癌中高表达的一种、但非唯一机制。 展开更多
关键词 HMGA2蛋白 卵巢肿瘤 微RNAS
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通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性(英文) 被引量：4
5
作者 何湘君 张旗 +1 位作者 刘玉京 潘秀英 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期691-698,共8页
目的:了解因某些microRNA(miRNA)家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法:采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以... 目的:了解因某些microRNA(miRNA)家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法:采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果:提高退火温度12℃～14℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′末端置于miRNA第18～20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论:精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。 展开更多
关键词 微RNAS 逆转录聚合酶链反应 DNA引物 基因表达谱
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降钙素基因相关肽对大鼠成骨细胞表达转录因子RUNX2的影响 被引量：2
6
作者 韩娜 姜保国 +3 位作者 王天兵 张培训 寇玉辉 张殿英 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期652-656,共5页
目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠颅盖骨来源成骨细胞RUNX2因子表达水平的影响,进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法:用酶消化法培养原代大鼠成骨细胞并鉴定;MTT法筛选促进成骨细胞增... 目的:探讨外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠颅盖骨来源成骨细胞RUNX2因子表达水平的影响,进一步了解CGRP促进成骨的作用机制。方法:用酶消化法培养原代大鼠成骨细胞并鉴定;MTT法筛选促进成骨细胞增殖的有效浓度,将含有不同浓度CGRP的条件培养基加入大鼠成骨细胞培养体系中,药物作用48 h后,用半定量RT-PCR和Western blotting方法检测大鼠成骨细胞转录因子RUNX2在mRNA和蛋白水平的表达。结果:当CGRP浓度在10-8～10-6mol/L范围时,对成骨细胞增殖有明显促进作用,增殖率分别为71.9%,142.1%,321.0%,P<0.05;浓度为10-7和10-6mol/L的CGRP作用于成骨细胞48 h后,转录因子RUNX2在mRNA水平的表达量明显上调,分别增强(46.2±11.2)%和(58.6±14.0)%,P<0.05;转录因子RUNX2的蛋白表达变化趋势与其mRNA的表达变化趋势基本一致。结论:一定浓度的CGRP对大鼠成骨细胞转录因子RUNX2的表达有直接促进作用,RUNX2可能参与了CGRP刺激成骨细胞增殖反应的机制。 展开更多
关键词 降钙素基因相关肽 成骨细胞 转录因子RUNX2 大鼠
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口腔鳞癌中CD24的表达、作用和治疗靶点价值 被引量：1
7
作者 莫珩 高承志 +3 位作者 王少杰 李玫 董建强 郁卫东 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期16-22,共7页
目的:明确口腔鳞癌组织和细胞中黏液素样细胞表面黏附分子CD24的表达模式、作用及其作为治疗靶点的潜在价值。方法:利用免疫组化、real-time RT-PCR和Western blot方法,明确CD24在78例人口腔组织标本和59例动物模型金地鼠(Hamster bucc... 目的:明确口腔鳞癌组织和细胞中黏液素样细胞表面黏附分子CD24的表达模式、作用及其作为治疗靶点的潜在价值。方法:利用免疫组化、real-time RT-PCR和Western blot方法,明确CD24在78例人口腔组织标本和59例动物模型金地鼠(Hamster buccal)颊囊组织标本,以及口腔癌前病变上皮细胞DOK4、口腔鳞癌细胞CAL-27和WSU-HN6中的表达模式;以CAL-27和WSU-HN6细胞为模型,明确在常规和无血清成球培养条件下,全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)和CD24抗体对CAL-27和WSU-HN6细胞及肿瘤球生长的影响,并观察它们是否影响这两种细胞中CD24的表达。结果:人和金地鼠组织的免疫组织染色结果显示,在正常/单纯增生组织、轻度/中度异常增生组织、重度异常增生和鳞癌组织中均依次呈现CD24表达递增的现象(P<0.05);与DOK细胞相比较,CAL-27和WSU-HN6口腔鳞癌细胞中CD24表达上调(P<0.05)。相对于癌前病变细胞DOK,口腔鳞癌细胞CAL-27和WSU-HN6具有更强的增殖和肿瘤球成球的潜能(P<0.05)。ATRA能够有效地抑制这两种口腔鳞癌细胞的CD24表达、体外增殖和肿瘤球形成的能力(P<0.05),而CD24抗体虽然也一样能够抑制口腔鳞癌细胞的增殖和肿瘤球形成(P<0.05),但却不影响其CD24的表达。结论:CD24在口腔鳞癌中表达上调,具有促进口腔鳞癌细胞增殖和肿瘤球形成的作用,维甲酸和CD24抗体皆能以CD24为靶点有效地抑制口腔鳞癌细胞的增殖和肿瘤球形成。 展开更多
关键词 口腔肿瘤 癌 鳞状细胞 抗原 CD24 维甲酸 细胞增殖
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MicroRNAs在唐氏综合征模型小鼠海马中的异常表达 被引量：3
8
作者 张育军 何湘君 +1 位作者 刘玉京 张旗 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期173-178,共6页
目的:寻找唐氏综合征模型鼠Ts65Dn和对照二倍体组小鼠海马组织中差异表达的microRNAs。方法:从小鼠的海马组织中提取小分子RNA,采用RNA加尾和引物延伸RT-PCR法检测microRNAs。通过geNorm软件和Normfinder软件分析选择最佳的内参照基因,... 目的:寻找唐氏综合征模型鼠Ts65Dn和对照二倍体组小鼠海马组织中差异表达的microRNAs。方法:从小鼠的海马组织中提取小分子RNA,采用RNA加尾和引物延伸RT-PCR法检测microRNAs。通过geNorm软件和Normfinder软件分析选择最佳的内参照基因,将每种microRNAs按其引物Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增,并计算每种相对于microRNAs内参照基因的表达量。结果:geNorm和Normfinder两种方法均选定miR-27a为最稳定的内参照基因,共检测了52种microRNAs,其中miR-33和miR-19a在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著下调,miR-130在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著上调,小鼠16号染色体三体区段包含的miR-802在Ts65Dn小鼠和对照二倍体小鼠海马组织中表达量均低,差异没有统计学意义。结论:MicroRNAs在Ts65Dn小鼠海马组织中的异常表达可能与唐氏综合征脑发育不良有关。 展开更多
关键词 微RNAS 唐氏综合征 基因表达 逆转录聚合酶链反应 小鼠
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TIMP-1基因缄默削弱SH-SY5Y细胞的增殖潜能并诱导其凋亡增强
9
作者 陈敏霞 郁卫东 +4 位作者 梁蓉 杨丽君 晁爽 赵贺华 郭静竹 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1021-1028,共8页
前期研究发现,人基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)在唐氏综合征(Down’s syndrome,DS)胎儿脑组织内表达下调.为了探讨TIMP-1表达下调参与DS脑病变发生的可能机制,本研究以人神经母细胞瘤... 前期研究发现,人基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)在唐氏综合征(Down’s syndrome,DS)胎儿脑组织内表达下调.为了探讨TIMP-1表达下调参与DS脑病变发生的可能机制,本研究以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为模型,观察TIMP-1基因沉默后对其增殖和凋亡的影响.应用LipofectaminTM2000将TIMP-1特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)导入SH-SY5Y细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达TIMP-1-shRNA细胞株;应用RT-PCR、real-time PCR和Western印迹对干扰效率进行鉴定:与SH-SY5Y细胞相比,无论在mRNA水平还是蛋白水平,SH-SY5Y-TIMP-1-shRNA细胞中TIMP-1的表达显著下调(下调率接近100%).结果显示,已成功构建了TIMP-1基因沉默的SH-SY5Y细胞模型.在此基础上,通过MTT检测发现,TIMP-1基因沉默后SH-SY5Y细胞增殖减慢;流式细胞仪和荧光显微镜凋亡检测显示,TIMP-1基因沉默后SH-SY5Y细胞凋亡明显增加.这些研究结果表明,TIMP-1基因沉默能削弱SH-SY5Y细胞的增殖能力并增强SH-SY5Y的凋亡效应,提示TIMP-1可能是通过影响神经细胞的增殖和凋亡参与DS智力低下的发病过程. 展开更多
关键词 TIMP-1 基因沉默 增殖 凋亡 SH-SY5Y细胞
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