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人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选 被引量:4
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作者 丁治国 何蓓 +3 位作者 陈晓珩 汪唐顺 高翔 李乃卿 《中国现代普通外科进展》 CAS 2013年第2期85-88,共4页
目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α... 目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。 展开更多
关键词 慢病毒载体 血管内皮生长因子基因 RNA干扰 MHCC97L细胞
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STAT1过表达慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达 被引量:4
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作者 丁治国 何蓓 +3 位作者 陈晓珩 汪唐顺 高翔 李乃卿 《中国现代普通外科进展》 CAS 2013年第12期931-934,共4页
目的:构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。方法:根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒... 目的:构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。方法:根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用荧光定量PCR和Western blot检测原始细胞株(MHCC97L),稳转细胞株(MHCC97-stat1)中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。结果:测序证实STAT1基因过表达载体构建成功。过表达慢病毒包装成功。慢病毒转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达显著增加。结论:STAT1基因过表达慢病毒载体构建成功,并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。 展开更多
关键词 肝肿瘤 MHCC97L细胞 STAT1基因 慢病毒载体
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参芪扶正注射液联合IFN-α对肝癌细胞STAT1基因表达的影响 被引量:3
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作者 陈晓珩 何蓓 +6 位作者 李会龙 户蕊 李璐 王鑫 汪唐顺 李乃卿 丁治国 《中国现代普通外科进展》 CAS 2017年第6期421-425,共5页
目的:研究参芪扶正注射液与干扰素α(IFN-α)联用时对肝癌细胞STAT1基因表达的影响,探讨其对IFN-α协同增效的作用机制。方法:运用MTT法检测IFN-α注射液单独或与参芪扶正注射液联合对MHCC97-L细胞增殖的影响;运用Real-time PCR和Wester... 目的:研究参芪扶正注射液与干扰素α(IFN-α)联用时对肝癌细胞STAT1基因表达的影响,探讨其对IFN-α协同增效的作用机制。方法:运用MTT法检测IFN-α注射液单独或与参芪扶正注射液联合对MHCC97-L细胞增殖的影响;运用Real-time PCR和Western-blot分别检测IFN-α单独或与参芪扶正注射液联用对STAT1 RNA和蛋白质表达的影响;构建STAT1干扰慢病毒载体并实现其在MHCC97-L中表达,通过RT-PCR、We s te rn-Blot验证其干扰STAT1表达的有效性;MTT法检测IFN-α单独或联合参芪扶正注射液对STAT1基因"沉默"细胞株增殖的影响。结果 :与单独使用IFN-α相比,参芪扶正注射液与IFN-α联用可以增强IFN-α对人肝癌MHCC97-L的抑制作用(P<0.01),并上调STAT1 mRNA(P<0.05)和蛋白质的表达(P<0.05);成功构建STAT1基因"沉默"的MHCC97-L细胞株;参芪扶正注射液协同IFN-α对STAT1基因"沉默"MHCC97-L的抑制率与单独使用IFN-α差异无统计学意义(P>0.05)。结论:参芪扶正注射液可上调人肝癌细胞MHCC97-L中STAT1的表达,从而提高IFN-α的疗效。 展开更多
关键词 肝癌 MHCC97- L STAT1 干扰素 α 参芪扶正注射液
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基于RNAi技术研究参芪扶正注射液联合IFN-α对肝癌细胞增殖能力的影响 被引量:4
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作者 陈晓珩 何蓓 +8 位作者 李会龙 李哲 王鑫 李璐 户蕊 黄盛 付金香 李乃卿 丁治国 《中国现代普通外科进展》 CAS 2018年第5期337-341,共5页
目的:研究参芪扶正注射液与干扰素α(IFN-α)联用时对肝癌细胞增殖能力的影响,并通过RNA干扰技术明确其对IFN-α协同增效的作用机制。方法:运用细胞增殖实验(MTT)技术检测IFN-α注射液(6000 IU)单独或与参芪扶正注射液(0.5 g/L)联合时对... 目的:研究参芪扶正注射液与干扰素α(IFN-α)联用时对肝癌细胞增殖能力的影响,并通过RNA干扰技术明确其对IFN-α协同增效的作用机制。方法:运用细胞增殖实验(MTT)技术检测IFN-α注射液(6000 IU)单独或与参芪扶正注射液(0.5 g/L)联合时对SMMC-7721细胞增殖能力的影响;用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术和蛋白质印迹法(Western-blot)分别检测IFN-α单独或与参芪扶正注射液联用时,实验组、阴性对照组(NaCl)和空白对照组中STAT1的RNA转录和蛋白质表达情况,确定参芪扶正注射液对STAT1转录和表达的影响;运用Western blot检验STAT1基因经RNA干扰后SMMC-7721的STAT1蛋白质表达,确定干扰效果;MTT实验检测IFN-α单独或联合参芪扶正注射液作用于STAT1基因"敲低"细胞株时,对细胞增殖能力的影响。结果:与单独使用IFN-α及参芪扶正注射液相比,小剂量参芪扶正注射液与IFN-α联用可以增强IFN-α对人肝癌细胞SMMC-7721增殖能力的抑制作用,并上调STAT1 mRNA和蛋白质的表达;SMMC-7721的STAT1基因"敲低"细胞株中STAT1蛋白表达明显降低;针对SMMC-7721的STAT1基因"敲低"细胞株,参芪扶正注射液协同IFN-α与单独IFN-α及阴性对照组相比,对细胞增殖能力的影响无显著性差异。结论:参芪扶正注射液通过上调人肝癌细胞SMMC-7721中STAT1的表达,是提升干扰素α对肝癌细胞增殖能力抑制作用的主要机制之一。 展开更多
关键词 参芪扶正注射液 IFN-Α SMMC-7721 RNAI
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RNA干扰技术探讨参芪扶正注射液对MHCC97L细胞侵袭力的影响 被引量:2
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作者 陈晓珩 何蓓 +6 位作者 李会龙 户蕊 李璐 王鑫 汪唐顺 李乃卿 丁治国 《中国现代普通外科进展》 CAS 2017年第7期505-510,共6页
目的:通过检测参芪扶正注射液对肝癌MHCC97L细胞侵袭力及其VEGF基因表达的影响,明确其降低肝癌瘤株侵袭力的作用,并通过RNA干扰技术加以验证。方法:在MHCC97L体外培养系中加入参芪扶正注射液(0.5 g/L)作用24 h后,Transwell检测参芪扶正... 目的:通过检测参芪扶正注射液对肝癌MHCC97L细胞侵袭力及其VEGF基因表达的影响,明确其降低肝癌瘤株侵袭力的作用,并通过RNA干扰技术加以验证。方法:在MHCC97L体外培养系中加入参芪扶正注射液(0.5 g/L)作用24 h后,Transwell检测参芪扶正注射液对MHCC97L细胞侵袭性的影响;同时使用Real-time PCR和Western-blot分别检测药物组、阴性对照组和空白对照组中VEGF基因的转录与表达情况,确定参芪扶正注射液对VEGF基因转录与表达的影响;构建VEGF干扰慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达,并通过RT-PCR、Western-Blot进行验证,确定其干扰VEGF基因表达的有效性;Transw ell检测参芪扶正注射液对VEGF"沉默"瘤株侵袭力的影响并与正常瘤株进行比较。结果:参芪扶正注射液能够降低MHCC97L细胞中VEGF基因的转录与表达(P<0.05),并能够降低肿瘤侵袭力(P<0.05);VEGF基因"沉默"瘤株构建成功;VEGF基因"沉默"后,参芪扶正注射液对MHCC97L瘤株侵袭力的影响不显著(P>0.05)。结论:参芪扶正注射液可以通过抑制MHCC97L细胞VEGF基因的表达以降低其侵袭力。 展开更多
关键词 肝肿瘤 参芪扶正注射液 VEGF 侵袭力
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STAT1干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应测定 被引量:2
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作者 丁治国 何蓓 +5 位作者 陈晓珩 李会龙 高翔 张韬 王鑫 李乃卿 《中国现代普通外科进展》 CAS 2015年第11期841-844,共4页
目的 :构建STAT1基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并测定其基因沉默效应。方法 :根据人STAT1基因序列,设计干扰序列,将Oligo退火成双链并连接穿梭载体p LKO-1-EGFP-puro-sh RNA,构建sh RNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序... 目的 :构建STAT1基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并测定其基因沉默效应。方法 :根据人STAT1基因序列,设计干扰序列,将Oligo退火成双链并连接穿梭载体p LKO-1-EGFP-puro-sh RNA,构建sh RNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-time PCR和Western Blot检测RNAi组(MHCC97L-stat1-sh RNA-1)和对照组(MHCC97L-stat1)中STAT1基因的表达情况,确定其干扰STAT1表达的有效性。结果:测序证实慢STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48 h后,STAT1基因在m RNA水平和蛋白质水平上表达明显降低。结论:STAT1基因RNAi慢病毒载体构建成功,能够在人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株中表达,并具有显著的基因沉默效果。 展开更多
关键词 STAT1基因 慢病毒载体 RNA干扰 MHCC97L细胞
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针对人STAT1基因的RNA干扰有效靶点的设计与筛选 被引量:1
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作者 丁治国 何蓓 +5 位作者 陈晓珩 李会龙 高翔 张韬 王鑫 李乃卿 《中国现代普通外科进展》 CAS 2015年第12期925-928,共4页
目的:设计并筛选针对人STAT1基因有效的RNA干扰靶点。方法:根据人STAT1基因序列,设计3个干扰序列,将oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5a,进行测序验证。在脂质体介... 目的:设计并筛选针对人STAT1基因有效的RNA干扰靶点。方法:根据人STAT1基因序列,设计3个干扰序列,将oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5a,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-timePCR检测干扰效果。结果:测序证实3个STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48h后,STAT1基因在mRNA水平表达均受到抑制,其中MHCC9-L-stat1-shRNA-1序列效果最佳,对STAT1基因表达的干扰效率可达81.4%。结论:成功构建并筛选了人STAT1基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究STAT1基因与抗肿瘤药物药效关系奠定基础。 展开更多
关键词 STAT1基因 慢病毒载体 RNA干扰 MHCC97L细胞
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