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组成型启动子P_(ldh)对乳酸菌表达系统外源基因表达的影响研究
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作者 刘芯孜 赵海渊 +7 位作者 鞠宁 陈莹 王梓 孟伟静 李佳璇 姜艳平 崔文 王晓娜 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2937-2947,共11页
旨在利用AmpR(氨苄青霉素抗性)报告基因表达系统,构建不同数量乳酸菌组成型启动子P_(ldh)串联、启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统,分别检测AmpR报告基因转录水平、蛋白表达量并评价AMPR酶活性,从而筛选出稳定... 旨在利用AmpR(氨苄青霉素抗性)报告基因表达系统,构建不同数量乳酸菌组成型启动子P_(ldh)串联、启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统,分别检测AmpR报告基因转录水平、蛋白表达量并评价AMPR酶活性,从而筛选出稳定且强表达的组成型多启动子表达系统,为乳酸菌活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。对P_(ldh)启动子进行生物信息学分析,构建不同数量启动子P_(ldh)串联的重组乳酸菌以及启动子与外源基因AmpR不同顺序重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR、Western blot、间接ELISA检测以及氨苄青霉素活菌筛选试验综合评估不同表达系统中外源基因表达的强弱。PCR结果显示重组乳酸菌成功扩增出600、900、2300和2300 bp的P_(ldh)-P_(ldh)、P_(ldh)-P_(ldh)-P_(ldh)、P_(ldh)-AmpR-P_(ldh)-AmpR和P_(ldh)-P_(ldh)-AmpR-AmpR目的片段;Western blot结果显示重组菌均可表达AMPR蛋白,目的蛋白大小均约为28 ku。间接ELISA、荧光定量PCR和AMPR酶活性检测结果均显示,在不同数量启动子P_(ldh)串联乳酸菌表达载体系统中,三启动子驱动AmpR报告基因表达的效率显著高于双启动子(P<0.05),三启动子、双启动子驱动AmpR报告基因表达的效率均极显著高于单启动子(P<0.01),且均极显著高于对照菌pPG-Ampr/HLJ-27(P<0.01);在启动子P_(ldh)与AmpR报告基因不同顺序的乳酸菌表达载体系统中,重组菌pPG-P_(ldh)-P_(ldh)-Ampr-Ampr/HLJ-27驱动AmpR报告基因表达的效率极显著高于重组菌pPG-P_(ldh)-Ampr-P_(ldh)-Ampr/HLJ-27(P<0.01)。本研究利用AmpR报告基因成功构建了5种组成型多启动子P_(ldh)乳酸菌表达系统,结果显示在不同数量启动子P_(ldh)串联驱动单外源蛋白载体系统中,启动子调控转录进而驱动外源基因表达量与启动子数量呈正相关;在双启动子驱动双外源蛋白载体系统中,连续串联两个启动子调控转录进而驱动双外源基因表达效率显著高于两个启动子分别驱动双外源基因表达效率;以上数据为乳酸菌表达载体对外源蛋白的表达效率优化提供了必要的依据。 展开更多
关键词 乳酸菌表达系统 组成型启动子P_(ldh) 启动子活性 外源基因表达效率
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表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组罗伊氏黏液乳杆菌诱导仔猪特异性免疫应答的研究
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作者 国桂海 马茹梦 +9 位作者 尹方洁 刘芯孜 王梓 孟伟静 李佳璇 崔文 姜艳平 唐丽杰 赵海渊 王晓娜 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第9期4581-4592,共12页
旨在研究猪源罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)作为活菌载体表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原S1,口服免疫新生仔猪后进行免疫效果评价,以期研制安全高效的口服黏膜疫苗制剂。本研究构建表达PEDV S1的重组乳酸菌pPG-T7g10-S... 旨在研究猪源罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)作为活菌载体表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原S1,口服免疫新生仔猪后进行免疫效果评价,以期研制安全高效的口服黏膜疫苗制剂。本研究构建表达PEDV S1的重组乳酸菌pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31,进行生长特性、重组质粒的遗传稳定性、体外IPEC-J2细胞黏附特性,并进行新生仔猪口服重组菌免疫效果的评估。结果显示,重组菌pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31相对于亲本株其生长特性未发生显著改变,质粒能够稳定遗传,在仔猪空肠具有较强的定植能力;新生仔猪口服免疫重组菌后,产生黏膜特异性SIgA抗体与血清特异性IgG抗体,且均具有中和PEDV的活性,能够诱导仔猪产生Th1、Th2和Th17型细胞免疫应答反应。综上所述,本研究成功构建重组乳酸菌pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31,口服免疫重组菌可诱导仔猪显著产生体液免疫、黏膜免疫和Th1、Th2和Th17型细胞免疫应答,为开发PEDV的口服疫苗候选制剂奠定了理论和实验基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻 猪源罗伊氏黏液乳杆菌 口服疫苗
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不同猪源受体菌表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原S1诱导免疫应答的比较研究 被引量：4
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作者 马茹梦 赵玉梁 +12 位作者 马明爽 国桂海 刘芯孜 李佳璇 崔文 姜艳平 单智夫 周晗 王丽 乔薪瑗 唐丽杰 王晓娜 李一经 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2090-2099,共10页
旨在比较猪源副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)作为口服疫苗载体,表达外源蛋白刺激仔猪产生免疫能力的强弱,以期选取合适乳酸菌作... 旨在比较猪源副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)作为口服疫苗载体,表达外源蛋白刺激仔猪产生免疫能力的强弱,以期选取合适乳酸菌作为受体菌载体。本研究首先体外鉴定表达PEDV S1蛋白的重组猪源副干酪乳酪杆菌(pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2)、猪源罗伊氏黏液乳杆菌(pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31)、猪源约氏乳酸杆菌(pPG-T7g10-S1/L.johnsonii 6332)的耐酸耐胆盐能力,考察3株重组菌的抗逆性。结果表明,3株重组菌均能够耐受酸和胆盐环境,且与其野生型菌株没有显著差异。接下来为比较3株重组菌的免疫效果,口服免疫初生仔猪后,利用间接ELISA和中和试验检测仔猪产生的特异性抗体水平及其中和活性;并测定免疫后仔猪血清和肠黏膜中各细胞因子水平。结果显示,口服免疫后,与对照组相比,3株免疫组仔猪血清IgG抗体和鼻拭子、肛拭子、肠黏液中SIgA抗体水平均显著升高,且可持续至第28天左右,其中pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组诱导产生的抗体水平显著高于其他两组免疫组(P<0.05);仔猪产生特异性的IgG和SIgA对PEDV均具有中和活性。仔猪血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平和对照组相比显著升高(P<0.05),但3株重组菌组间细胞因子水平未见明显差异;仔猪空肠黏膜中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17、IL-21、TGF-β、APRIL和BALL水平与对照组相比有所升高,且pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组IL-4、IL-5、IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21和BALL相比其他组显著升高(P<0.05)。综上所述,本研究分别将质粒组成型表达PEDV主要保护性抗原S1的重组猪源副干酪乳酪杆菌、猪源罗伊氏黏液乳杆菌和猪源约氏乳酸杆菌口服免疫仔猪,结果显示能够刺激机体产生针对PEDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫,且相较于其他2株重组菌,重组猪源副干酪乳酪杆菌pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2的口服免疫效果最好。该试验结果为构建更为有效的乳酸菌口服疫苗提供了科学数据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻 S1蛋白 副干酪乳酪杆菌 罗伊氏黏液乳杆菌 约氏乳杆菌 口服疫苗 免疫分析
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