新疆包虫病流行病学及防控策略 被引量：7

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作者 孟庆玲 乔军 《动物医学进展》 北大核心 2023年第11期112-116,共5页

包虫病是新疆地区人畜间流行的重要疫病之一。2005年以来,国家以及新疆地方各级政府加大了对包虫病的防控力度,取得了良好的防控成效。现有的流行病学调查表明,新疆细粒棘球绦虫的基因型主要为G1、G3和G6,多房棘球绦虫有16个单倍型。囊... 包虫病是新疆地区人畜间流行的重要疫病之一。2005年以来,国家以及新疆地方各级政府加大了对包虫病的防控力度,取得了良好的防控成效。现有的流行病学调查表明,新疆细粒棘球绦虫的基因型主要为G1、G3和G6,多房棘球绦虫有16个单倍型。囊型包虫病在儿童、1岁以内绵羊的感染率分别由控制前的6.7%和4.5%下降到2.2%和1.3%;家犬细粒棘球绦虫的感染率由11.6%下降至1.6%。对终末宿主犬主要采取“犬犬投药、月月驱虫”的策略;对中间宿主绵羊实行强制免疫的防控措施;对患病脏器进行无害化处理;加大宣传、科学防范、加强联防联控等措施。泡型包虫病在野生动物为主的病原循环链间传播,目前尚缺乏有效的措施用于泡型包虫病的防控。 展开更多

关键词 包虫病 流行病学 防控策略

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牛种布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株生物学特性及其免疫原性研究 被引量：2

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作者 徐朕宇 邓肖玉 +7 位作者 王月丽 孙灿 吴澳迪 曹剑 易继海 王勇 王震 陈创夫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2135-2145,共11页

布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失... 布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失,通过qRT-PCR检测布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株中的BtpA mRNA表达水平,并探究布鲁氏菌A19株和A19ΔBtpA缺失株在生长曲线、胞内生存、黏附侵袭和体外应激方面的差异。此外,将A19株和A19ΔBtpA缺失株免疫小鼠,在免疫后的第7、14、21、28和35天使用间接ELISA检测小鼠体内的布鲁氏菌特异性抗体水平;通过ELISpot检测免疫第21天时小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达水平,利用流式细胞术测定了小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞的分类情况。结果表明:成功构建了A19ΔBtpA缺失株,A19ΔBtpA缺失株中BtpA的转录水平显著低于A19株,A19ΔBtpA缺失株与亲本株在生长曲线、胞内生存和黏附侵袭方面呈现相似的趋势。而体外应激试验显示,高渗应激条件下A19ΔBtpA缺失株的存活菌量明显低于A19株(P<0.05)。免疫原性研究中,与PBS组相比,A19组和A19ΔBtpA组均可极显著诱导小鼠产生布鲁氏菌特异性抗体(P<0.01);与A19组相比,A19ΔBtpA组淋巴细胞IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05),使小鼠产生的IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值显著增高(P<0.05)。BtpA基因缺失不会影响布鲁氏菌A19体外胞内增殖,但可能参与布鲁氏菌抗高渗环境能力相关。此外,A19ΔBtpA缺失株比A19株更好地诱导Th1型免疫应答,诱导宿主产生与A19株相当的IgG特异性抗体,具有布鲁氏菌基因缺失疫苗的潜力。该研究将为进一步探究布鲁氏菌的致病机制和开发基因缺失株疫苗提供理论基础和数据支持。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BtpA 生物学特性 免疫原性

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一株具有多种毒力基因的粪肠球菌噬菌体的研究分析 被引量：1

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作者 常军帅 赵玉 +3 位作者 段付霜 屈勇刚 梁晏 李娜 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期182-188,共7页

以之前分离出的奶牛乳房炎源粪肠球菌SL22为宿主菌,从临床型乳房炎乳样中分离纯化噬菌体,对其进行生物学特性分析、小鼠治疗试验及毒力基因与耐药基因检测。结果分离到1株噬菌体,该噬菌体形成的噬菌斑如针尖状,电镜下发现该噬菌体无尾,... 以之前分离出的奶牛乳房炎源粪肠球菌SL22为宿主菌,从临床型乳房炎乳样中分离纯化噬菌体,对其进行生物学特性分析、小鼠治疗试验及毒力基因与耐药基因检测。结果分离到1株噬菌体,该噬菌体形成的噬菌斑如针尖状,电镜下发现该噬菌体无尾,头部呈对称多面体,直径约66 nm,将其命名为vB_Eco T_PSL22(简称PSL22);只裂解其宿主菌,核酸类型为dsDNA;最佳感染复数为0.1,裂解量约为52 PFU/cell;在p H4.0~12.0时活性稳定,能耐受60℃左右高温。对小鼠治愈率为33.33%(2/6),含有2个耐药基因(Acc和aac(3)-Ⅳ)和4种毒力基因(gelE、cylA、ace和efaA)。通过本次试验,可为临床型乳房炎奶牛乳房中噬菌体的多样性研究提供参考,也可为研究奶牛乳房中的微生态系统提供依据。 展开更多

关键词 粪肠球菌 噬菌体 生物学特性 耐药基因 毒力基因

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布鲁氏菌T4SS效应蛋白BspJ的生物学功能研究

4

作者 承潇潇 任文浩 +6 位作者 郑炜 姚梦欣 徐艺玫 李芮芮 陈创夫 马忠臣 王勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期895-901,共7页

为探究布鲁氏菌IV型分泌系统(T4SS)效应蛋白BspJ的生物学功能,本研究利用同源重组和载体回补方法,以粗糙型牛种布鲁氏菌(RB51)为亲本株,构建布鲁氏菌BspJ基因缺失菌株(ΔBspJ)与BspJ基因回补株(pBspJ),并经PCR和测序鉴定。将ΔBspJ与p B... 为探究布鲁氏菌IV型分泌系统(T4SS)效应蛋白BspJ的生物学功能,本研究利用同源重组和载体回补方法,以粗糙型牛种布鲁氏菌(RB51)为亲本株,构建布鲁氏菌BspJ基因缺失菌株(ΔBspJ)与BspJ基因回补株(pBspJ),并经PCR和测序鉴定。将ΔBspJ与p BspJ连续传代至15代,经PCR鉴定ΔBspJ与pBspJ的遗传稳定性,结果显示,正确构建了ΔBspJ与pBspJ,且各代次ΔBspJ均未扩增出目的条带、p BspJ均扩增出目的条带,二者遗传稳定性好。将RB51、ΔBspJ、pBspJ分别于酸性(p H2.5/37℃)、碱性(pH11.5/37℃)、高盐(1.5 mol/L NaCl/37℃)及热休克(pH7.0/50℃)等不同体外条件下培养,统计各菌株生存率;将RB51、ΔBspJ、p BspJ分别以感染复数(MOI)100侵染小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)后,采用q RT-PCR检测凋亡相关因子基因BAX、BCL2、CASP3、CASP8及炎症相关因子基因CDK2、m TOR、TRAF3IP2、P62、IL-8的转录水平;另外,于侵染后24 h、48 h时分别裂解上述3种侵染细胞,计数各菌株的细菌菌落总数(CFU),分析各菌株的胞内生存能力。结果显示,相比于RB51,ΔBspJ在pH2.5/37℃的TSB液体培养基中的生存率极显著下降(P<0.01),在pH11.5/37℃、pH7.0/50℃、1.5 mol/L NaCl/37℃的TSB液体培养基中的生存率极显著下降(P<0.001);相比RB51侵染的RAW264.7细胞,ΔBsp J侵染的RAW264.7细胞中BAX、CASP3、CASP8基因的转录水平极显著升高(P<0.001),BCL2基因的转录水平极显著下降(P<0.001),TRAF3IP2基因的转录水平极显著升高(P<0.0001),P62基因转录水平极显著升高(P<0.01),IL-8、mTOR基因的转录水平显著升高(P<0.05),CDK2基因的转录水平无显著差异(P>0.05)。相比RB51,ΔBspJ的胞内生存能力在侵染24 h后显著下降(P<0.01),48 h后极显著下降(P<0.001)。上述试验中亲本株RB51组与回补株p BspJ组检测结果均无显著差异(P>0.05)。综上所述,本研究首次证实BspJ参与调控布鲁氏菌酸碱稳态和渗透压稳态,揭示了BspJ通过抑制宿主细胞的凋亡与炎症反应显著提高布鲁氏菌的胞内生存能力,为T4SS效应蛋白BspJ对布鲁氏菌致病机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BspJ基因 基因功能 凋亡 炎症

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牛支原体感染牛巨噬细胞对线粒体途径介导凋亡的影响

5

作者 唐恬 王振 +6 位作者 余梦环 徐坤 何瑞丽 秦田哲 陈创夫 马忠臣 王勇 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3625-3634,共10页

[目的]探究牛支原体石河子分离株感染牛巨噬细胞(BoMac)能否通过线粒体凋亡途径影响细胞增殖活力和凋亡。[方法]通过培养基培养及测定颜色变化单位(CCU)绘制牛支原体菌株生长曲线,确定其最高活力的培养时间;使用处于活力最高时的牛支原... [目的]探究牛支原体石河子分离株感染牛巨噬细胞(BoMac)能否通过线粒体凋亡途径影响细胞增殖活力和凋亡。[方法]通过培养基培养及测定颜色变化单位(CCU)绘制牛支原体菌株生长曲线,确定其最高活力的培养时间;使用处于活力最高时的牛支原体以不同感染复数(MOI)和不同感染时间感染牛巨噬细胞,分别利用实时荧光定量PCR和Western blotting试验检测线粒体凋亡通路核心分子Bax和Bcl-2的表达情况,通过CCK8试验检测细胞增殖活力水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。[结果]生长曲线分析结果显示,牛支原体石河子分离株12~54 h处在对数生长期,54~84 h处在平台期(滴度为109 CCU/mL),因此,选用培养54 h的牛支原体石河子分离株感染细胞。实时荧光定量PCR与Western blotting检测结果一致,即随感染时间和MOI的增加,促凋亡蛋白Bax基因及其蛋白表达量呈现上升趋势,抑凋亡蛋白Bcl-2基因及其蛋白表达量呈现下降趋势,其中牛支原体石河子分离株感染24 h时,Bax基因表达量极显著增加(P<0.01),Bcl-2基因表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax显著下降(P<0.05);当MOI为1000时Bax蛋白表达量极显著增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax极显著下降(P<0.01)。CCK8试验结果显示,随着感染时间和MOI的增加,牛巨噬细胞活力极显著降低(P<0.01),增殖抑制率为35%~45%。流式细胞术检测结果显示,感染后,牛巨噬细胞凋亡率为25%~45%。[结论]随着感染时间和MOI的增加,牛支原体石河子分离株可通过线粒体凋亡途径标志因子Bax和Bcl-2的表达诱导牛巨噬细胞凋亡,为进一步解析牛支原体的致病机制提供理论基础。 展开更多

关键词 牛支原体 牛巨噬细胞 线粒体凋亡途径 细胞增殖

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嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1调控宿主细胞剪接体转录机制的初步分析

6

作者 李芮芮 史梦华 +5 位作者 张妍 何洪琴 王雨璐 陈佳 王勇 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期39-48,共10页

为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1对宿主细胞内蛋白表达的影响,并初步分析Ats-1对宿主细胞剪接体的调控机制,本研究将嗜吞噬无形体的Ats-1基因克隆后连接至pcDNA3.1质粒,构建pcDNA3.1-Ats-1重组质粒,经PCR和测序鉴定正确后利用脂质体Lip... 为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1对宿主细胞内蛋白表达的影响,并初步分析Ats-1对宿主细胞剪接体的调控机制,本研究将嗜吞噬无形体的Ats-1基因克隆后连接至pcDNA3.1质粒,构建pcDNA3.1-Ats-1重组质粒,经PCR和测序鉴定正确后利用脂质体LipofectamineTM3000将其转染HEK293T细胞,继续培养至24 h、48 h时经western blot鉴定,结果显示,在48 ku(全长蛋白)和35 ku(成熟蛋白)出现特异性条带,表明Ats-1蛋白在细胞内可正确表达;且相较于24 h,48 h Ats-1蛋白在细胞内的表达量显著增加(P<0.05)。将重组质粒pcDNA3.1-Ats-1和空质粒pcDNA3.1分别转染HEK293T细胞,48 h后收获细胞并裂解取裂解液,利用同量异位标签定量蛋白质组学方法(iTRAQ)筛选Ats-1表达后宿主细胞内差异显著表达的蛋白,并采用基因本体论(GO)分析差异显著表达蛋白的功能,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析差异显著表达蛋白参与的信号通路。从剪接体通路选取34个差异表达蛋白通过q RT-PCR验证。i TRAQ结果显示,与空质粒转染细胞组相比,重组质粒pcDNA3.1-Ats-1转染细胞组共鉴定到852个差异显著表达的蛋白,其中表达显著上调蛋白406个,表达显著下调蛋白446个。GO功能分析结果显示,差异显著表达蛋白主要定位在膜、胞内膜结合细胞器、膜组分,参与大分子生物合成过程,有核酸和RNA结合活性。KEGG信号通路分析结果显示,差异显著表达蛋白显著富集于剪接体、N-糖基化、蛋白输出和RNA运输等信号通路。q RT-PCR结果显示,剪接体通路富集的差异显著表达蛋白仅O43143蛋白的m RNA转录水平上调,其他33个蛋白(A0A024R1K8、Q13435、Q13573等)m RNA的转录水平均显著下调,与iTRAQ的分析结果一致。综上所述,本研究首次证实Ats-1蛋白表达后可能参与宿主细胞中剪接体、N-糖基化和蛋白输出信号通路的调控,抑制宿主细胞中剪接体调控通路中部分蛋白的转录,从而可能抑制剪接体调控,该结果为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1在宿主细胞中的调控机制提供了新的方向和思路。 展开更多

关键词 Ats-1蛋白 ITRAQ 差异表达蛋白 剪接体

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基于牛支原体重组蛋白rMbovP730的间接ELISA方法的建立与应用

7

作者 李祥慧 徐明国 +4 位作者 马海龙 杨中莲 王勇 马忠臣 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期1255-1260,共6页

为获得具有良好反应原性和免疫原性的牛支原体重组蛋白rMbovP730,并建立基于rMbovP730的牛支原体抗体的间接ELISA检测方法,本研究经PCR扩增牛支原体MbovP730基因后,利用原核表达方式获得重组蛋白rMbovP730,利用牛支原体阳性血清经wester... 为获得具有良好反应原性和免疫原性的牛支原体重组蛋白rMbovP730,并建立基于rMbovP730的牛支原体抗体的间接ELISA检测方法,本研究经PCR扩增牛支原体MbovP730基因后,利用原核表达方式获得重组蛋白rMbovP730,利用牛支原体阳性血清经western blot鉴定其反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,采用棋盘法对各反应条件优化后建立牛支原体抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的重组蛋白rMbovP730约35 ku,可以与牛支原体阳性血清发生特异性反应;间接ELISA检测方法优化结果显示,重组rMbovP730蛋白最佳包被浓度为4μg/mL,待检血清最佳稀释度为1:100,兔抗牛IgG-HRP的最佳稀释度为1:10000。利用建立的间接ELISA方法检测牛支原体、牛布鲁氏菌、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒的阳性血清,结果显示,除牛支原体阳性血清检测结果为阳性外,其余病原体阳性血清均为阴性,该方法特异性较强;将牛支原体的阳性血清2倍倍比稀释(1:20~1:2560)后利用该方法检测,结果显示,该阳性血清以1:2560稀释后检测结果仍为阳性,敏感性较高;利用同一批次和不同批次制备的重组蛋白包被后进行批内、批间重复性试验,结果显示,批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性较好。利用建立的间接ELISA方法对130份临床牛血清样品检测,结果显示检出阳性血清58份,阴性血清72份,阳性率为44.6%;商品化ELISA试剂盒检出阳性血清28份,阴性血清102份,阳性率为21.5%;二者的总符合率为76.9%。本研究首次基于rMbovP730建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,为研制牛支原体抗体检测试剂盒奠定了基础。 展开更多

关键词 牛支原体 重组蛋白rMbovP730 原核表达 ELISA

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羊口疮病毒新疆流行株的分离鉴定及其遗传进化分析 被引量：11

8

作者 杨海波 孟庆玲 +7 位作者 乔军 才学鹏 贺志昊 刘昱成 彭叶龙 王国超 陈创夫 都曼.努尔坎杰 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第2期14-22,共9页

【目的】研究羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法,检测、分离和鉴定ORFV毒株,对分离... 【目的】研究羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法,检测、分离和鉴定ORFV毒株,对分离鉴定的3株ORFV毒株保护性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。【结果】从病料中分离鉴定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析结果显示,ORFV分离株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守,B2L和F1L基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为88.6%~97.9%和86.7%~97.4%;3个毒力基因的变异相对较大,尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为91.8%~97.3%,85.2%~97.0%和71.5%~98.5%。基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明,ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分离株均与台湾分离株的亲缘关系最近。【结论】试验分离的ORFV新疆流行株可能是由台湾株与其他毒株重组后产生的,且其毒力基因发生了较大的变异。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 分离鉴定 遗传进化分析 新疆

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单核细胞增生李斯特菌非编码RNA rli87基因缺失株的构建、鉴定及其生长特性初步研究 被引量：5

9

作者 谢堃 乔军 +6 位作者 孟庆玲 彭叶龙 赵海龙 马玉 陈诚 才学鹏 陈创夫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期998-1003,共6页

拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃... 拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg·mL-1)的抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组菌进行分子鉴定,测定缺失株与母源野毒株37℃条件下生长曲线。结果显示:PCR和测序结果证实成功获得了LM-Δrli87重组菌。通过25代的连续传代,PCR鉴定结果显示,该缺失株具有良好的遗传稳定性。与野毒株进行对比,在37℃条件下缺失株与野毒株的生长差异不显著(P>0.05)。非编码RNArli87基因在37℃条件下对LM生长没有明显的调控作用。 展开更多

关键词 rli87基因 LM感受态细胞 缺失株 生长特性 同源重组

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单核细胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的构建研究 被引量：3

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作者 彭叶龙 乔军 +4 位作者 孟庆玲 谢堃 赵海龙 宋雪梅 陈创夫 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第2期148-152,共5页

为了构建单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)ncRNA rli60基因缺失株,采用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法成功构建具有氯霉素抗性的pKSV7-Δrli60穿梭质粒,然后电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力... 为了构建单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)ncRNA rli60基因缺失株,采用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法成功构建具有氯霉素抗性的pKSV7-Δrli60穿梭质粒,然后电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力下进行同源重组,通过PCR进行重组菌鉴定。结果表明:成功筛选得到遗传性稳定的LM ncRNA rli60基因缺失株,为揭示LM ncRNA rli60基因功能提供了研究材料;同时,为进一步研究其在LM致病性及环境应激中的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯特菌 NCRNA rli60基因 同源重组 重叠延伸PCR

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细粒棘球蚴TP_x蛋白的分子特征与反应原性 被引量：2

11

作者 陈英 乔军 +6 位作者 孟庆玲 刘田莉 钟文强 贡莎莎 王熙凤 黄运福 才学鹏 《贵州农业科学》 CAS 2018年第1期68-73,共6页

为明确绵羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,TP_x)蛋白的反应原性,并进一步利用Eg TP_x重组蛋白作为Eg感染诊断中的候选标识分子奠定基础,根据GenBank中Eg TP_x基因的cDNA序列设计... 为明确绵羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,TP_x)蛋白的反应原性,并进一步利用Eg TP_x重组蛋白作为Eg感染诊断中的候选标识分子奠定基础,根据GenBank中Eg TP_x基因的cDNA序列设计特异性引物,以Eg头节为总RNA模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体,经测序验证后亚克隆至表达载体pET-32a中,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对表达的重组蛋白进行纯化及反应原性分析。结果表明:Eg TP_x cDNA全长为582个核苷酸,编码193个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个N端酰基化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位点,4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点;抗原表位区集中在58~94位和160~188位。重组菌可表达分子量为37ku的重组蛋白,重组蛋白Eg TP_x抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 细粒棘球蚴 EgTPx抗原基因 克隆 表达 反应原性

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0339基因的原核表达及免疫反应性分析 被引量：2

12

作者 刘来珍 孙志华 +3 位作者 刘娟 史静雪 陈创夫 张辉 《石河子大学学报(自然科学版)》 CAS 2015年第6期716-720,共5页

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339进行了表达纯化、免疫反应性分析,并研究了该蛋白对胚胎滋养层细胞(HPT-8)的细胞因子表达的影响。首先从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0339基因片段,亚克隆至融合表达载体p E... 本研究对布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339进行了表达纯化、免疫反应性分析,并研究了该蛋白对胚胎滋养层细胞(HPT-8)的细胞因子表达的影响。首先从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0339基因片段,亚克隆至融合表达载体p ET-28a,构建表达重组质粒p ET-28a-BMEI0339,并利用大肠杆菌进行表达。Western blotting方法检测其免疫学特性;用纯化的重组蛋白感染细胞,并检测IL-1、IL-10和TNF-α表达量。结果显示:成功构建了p ET-28a-BMEI0339原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BMEI0339蛋白,Western blotting检测其具有免疫反应性,该蛋白作用细胞后发现TNF-α的表达量低于BSA对照组,差异极显著(P<0.01);IL-1和IL-10的表达量差异不显著(P>0.05)。本研究成功表达了布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339,证实其具有一定的免疫原性,表明该蛋白影响了胚胎滋养层细胞TNF-α的表达。本研究为研究布鲁氏菌感染宿主细胞的致病机理提供理论基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMEI0339 原核表达 细胞因子 胚胎滋养层细胞

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RNaseⅢ RncS对单核细胞增生李斯特菌毒力的调控作用研究 被引量：2

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作者 王立霞 孟庆玲 +5 位作者 乔军 蔡扩军 王登峰 郭晶 伍晔晖 才学鹏 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第1期1-7,共7页

核糖核酸酶RnaseⅢ是一种调控nc RNA水平的重要酶系。为了解核糖核酸酶RnaseⅢRncS在单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力中的调控作用,本研究在构建LM-ΔrncS基因缺失突变株的基础上,通过动物感染试验检测强毒株LM-SB5与缺失株LM-Δrnc S对... 核糖核酸酶RnaseⅢ是一种调控nc RNA水平的重要酶系。为了解核糖核酸酶RnaseⅢRncS在单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力中的调控作用,本研究在构建LM-ΔrncS基因缺失突变株的基础上,通过动物感染试验检测强毒株LM-SB5与缺失株LM-Δrnc S对昆明系小鼠的LD50、存活能力、脏器载菌量及病理组织学产生的影响;利用细胞侵染试验检测强毒株与缺失株对小鼠巨噬细胞RAW264.7的粘附率、侵袭率及其在胞内生存繁殖能力的影响,分析RnaseⅢRncS对LM毒力的影响。结果显示,LM-SB5强毒株和LM-Δrnc S缺失株对昆明系小鼠的LD50分别为105.60 CFU、106.90 CFU;与LM-SB5强毒株相比,LM-Δrnc S的LD50升高了1.30个对数数量级,小鼠的存活时间明显延长,表明毒力显著降低;第3~5 d肝脏、脾脏载菌量显著减少(P<0.05),其中第4 d差异极显著(P<0.01);LM-Δrnc S缺失株对肝脏、脾脏、肾脏的病理损伤降低;LM-Δrnc S缺失株对RAW264.7细胞的粘附率和侵袭率均显著低于LM-SB5强毒株(P<0.01),在2~6 h之间,LM-Δrnc S缺失株在细胞内的细菌量显著低于LM-SB5强毒株(P<0.05),证实LM-Δrnc S在细胞内的生存增殖能力显著降低,提示rnc S基因对LM毒力发挥有一定的调控作用。本研究为进一步揭示RnaseⅢ在LM毒力中的分子调控机制提供了科学依据。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯特菌 核糖核酸酶RnaseⅢ rncS基因 毒力

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275基因的原核表达与鉴定 被引量：1

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作者 孙志华 张辉 +5 位作者 刘来珍 刘娟 韩玉霞 关团 王浩 陈创夫 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2016年第5期1-7,共7页

【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-... 【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-28a,构建表达重组质粒pET-28a-BPE123和pET-28aBPE275,在大肠杆菌中进行诱导表达,Western blot分析重组蛋白His-BPE123和His-BPE275的免疫学特性。【结果】PCR扩增获得了462bp的BPE123基因片段和762bp的BPE275基因片段,成功构建了pET-28a-BPE123、pET-28a-BPE275原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BPE123和BPE275蛋白,经SDS-PAGE检测,重组融合蛋白BPE123、BPE275的分子质量分别约为22和31ku,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别表达的蛋白。【结论】克隆了分泌蛋白BPE123、BPE275基因片段,并成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 Ⅳ型分泌系统 效应蛋白

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布鲁菌DK63＿426基因缺失株的构建及生物学特性研究 被引量：1

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作者 李明奇 王小凤 +5 位作者 郭嘉 赵天艺 刘航 张樊 吴长新 张辉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2020年第1期31-36,共6页

目的本研究构建了羊布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株,分析其在细胞内的生存繁殖和致炎能力。方法以羊布鲁菌16M株基因组为模板,利用融合PCR技术将DK 63_426基因的上下游同源臂和卡那抗性基因融合,连接到克隆载体上,通过基因重组构建布鲁... 目的本研究构建了羊布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株,分析其在细胞内的生存繁殖和致炎能力。方法以羊布鲁菌16M株基因组为模板,利用融合PCR技术将DK 63_426基因的上下游同源臂和卡那抗性基因融合,连接到克隆载体上,通过基因重组构建布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株16MΔDK 63_426,观察布鲁菌亲本株16M和16MΔDK 63_426的生长变化趋势,建立侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,检测亲本株和缺失株16MΔDK 63_426在胞内的生存能力,检测IL-6、TNF-α细胞因子释放量。结果成功构建了16MΔDK 63_426;在体外相同培养条件下该缺失株与亲本株生长趋势相似,培养12 h即进入对数生长期,30 h进入平台期;16MΔDK 63_426在浸染RAW264.7细胞12 h胞内存活率极显著低于亲本株(P<0.01),在浸染8 h时IL-6的分泌量缺失株组均显著低于亲本株(P<0.05),TNF-α的分泌量缺失株组均显著高于亲本株(P<0.05),在侵染12 h时IL-6的分泌量缺失株组均极显著低于亲本株(P<0.01),TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株(P<0.01)。结论DK 63_426基因的缺失可影响布鲁菌的胞内存活,影响相关炎症因子的表达,为布鲁菌感染机制的研究奠定理论基础。 展开更多

关键词 布鲁菌 缺失株 脂多糖 DK 63_426基因

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单核细胞增生李斯特菌sRNA伴侣分子hfq的基因克隆、表达及纯化

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作者 彭叶龙 乔军 +6 位作者 孟庆玲 谢堃 陈诚 刘田莉 马玉 才学鹏 陈创夫 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第5期80-84,共5页

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a(+)中,成功... 为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a(+)-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示:克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯特菌 hfq基因 sRNA伴侣分子 克隆 表达 纯化

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细粒棘球蚴Eg HSP20蛋白基因的分子特征、表达及其反应原性研究

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作者 陈英 乔军 +6 位作者 孟庆玲 钟文强 刘田莉 贡莎莎 王熙凤 黄运福 才学鹏 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期1547-1552,共6页

【目的】本文构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)HSP20基因的重组表达载体并表达、纯化重组蛋白,研究其反应原性。【方法】根据Gen Bank中Eg HSP20蛋白基因c DNA序列设计特异性引物,以细粒棘球蚴Eg头节总RNA为模板,进行RTPCR扩... 【目的】本文构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)HSP20基因的重组表达载体并表达、纯化重组蛋白,研究其反应原性。【方法】根据Gen Bank中Eg HSP20蛋白基因c DNA序列设计特异性引物,以细粒棘球蚴Eg头节总RNA为模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆至p MD19-T载体,测序验证后,将Eg HSP20抗原基因亚克隆至表达载体p ET-32a中,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化及反应原性分析。【结果】Eg HSP20 c DNA全长945个核苷酸,编码314个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,5个PKC磷酸化位点,10个CKⅡ磷酸化位点;抗原表位区集中在39~53位和120~168位。SDS-PAGE检测显示,重组菌可表达分子量为51 k Da的重组蛋白;Western blot结果显示,表达的重组蛋白Eg HSP20抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应。【结论】证实Eg HSP20蛋白具有较强的反应原性,为进一步利用Eg HSP20重组蛋白作为Eg感染诊断中候选标识分子奠定了前期基础。 展开更多

关键词 细粒棘球蚴 EG HSP20抗原基因 克隆 表达 反应原性

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布鲁菌基因缺失株△VceA的感染特征研究

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作者 刘航 何佳琪 +6 位作者 王小凤 李明奇 郭嘉 赵天艺 张樊 吴长新 张辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第6期68-72,共5页

本文研究了布鲁菌IV型分泌系统效应蛋白VceA缺失对细胞侵染和小鼠感染特征。培养布鲁菌S2308基因缺失突变株ΔVceA,测定ΔVceA在生长过程中的OD值并制作其生长曲线;在用布鲁菌VceA基因缺失株和其亲本株S2308株分别侵染HPT-8细胞后,检测... 本文研究了布鲁菌IV型分泌系统效应蛋白VceA缺失对细胞侵染和小鼠感染特征。培养布鲁菌S2308基因缺失突变株ΔVceA,测定ΔVceA在生长过程中的OD值并制作其生长曲线;在用布鲁菌VceA基因缺失株和其亲本株S2308株分别侵染HPT-8细胞后,检测细胞炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。采用ΔVceA和亲本株S2308分别侵染HPT-8细胞和感染小鼠,对HPT-8进行胞内CFU计数,对小鼠脾脏内进行CFU计数,研究基因缺失突变株ΔVceA的感染特征。结果显示,基因缺失株ΔVceA和亲本株S2308的生长曲线在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;VceA基因缺失株在侵染细胞的初期胞内CFU计数低于亲本株,之后和亲本株无显著差异;基因缺失株ΔVceA在感染小鼠初期脾脏内CFU计数时低于亲本株,在感染后期和亲本株无明显差异;基因缺失株ΔVceA在侵染HPT-8细胞12 h时TNF-α和IL-1β的分泌量缺失株显著低于亲本株。结果表明,VceA基因的缺失不影响布鲁菌的生长繁殖,在布鲁菌感染细胞后影响细胞因子的分泌,胞内外的生存繁殖力明显下降,为深入研究布鲁菌IV型分泌系统的作用和功能奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁菌 VceA 生长曲线 HPT-8细胞

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达及功能分析

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作者 豆晓霞 刘洋 +5 位作者 李敏 荆明龙 李明奇 王小凤 陈创夫 张辉 《江苏农业科学》 2018年第12期33-38,共6页

为构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达载体,并进行表达、鉴定。从羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M株的基因组中克隆BMEI0742基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-B... 为构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达载体,并进行表达、鉴定。从羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M株的基因组中克隆BMEI0742基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-BMEI0742利用大肠杆菌进行表达,并进行Western-Blot检测,对该蛋白功能进行生物信息学分析。成功构建了pET-28a-BMEI0742原核表达载体,SDS-PAGE检测结果显示,重组蛋白的分子量约是50 ku,BMEI0742蛋白可与布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。本研究成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因,并成功获得了BMEI0742蛋白,该蛋白具有与布鲁氏菌自身蛋白相同的抗原性,为布鲁氏菌翻译延伸因子Tu,为进一步研究其免疫性和保护性以及在布鲁氏菌的致病机制奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMEI0742基因 鉴定 原核表达 反应原性

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因的原核表达

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作者 刘来珍 孙志华 +3 位作者 刘娟 史静雪 陈创夫 张辉 《草食家畜》 2015年第5期25-30,共6页

【目的】构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因的原核表达载体,并进行免疫原性及其对人胚胎滋养层细胞(HPT-8)细胞因子表达量影响的分析。【方法】本研究从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0580基因片段,亚... 【目的】构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因的原核表达载体,并进行免疫原性及其对人胚胎滋养层细胞(HPT-8)细胞因子表达量影响的分析。【方法】本研究从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0580基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-BMEI0580利用大肠杆菌进行表达,并进行Western-Blot检测,ELISA方法检测细胞因子的表达量。【结果】成功构建了pET-28a-BMEI0580原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BMEI0580基因,经过SDS-PAGE检测,重组蛋白的分子量大约是57kDa,Western-Blot检测其具有免疫特性。【结论】本实验成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因,为进一步研究其免疫性和保护性奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMEI0580基因 原核表达

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