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新疆南疆地区蜱蝇种类的鉴定与其携带的病原及遗传进化分析
1
作者 戴君昂 赵晶 +8 位作者 邓兴梅 韩馨馨 刘雪峰 张会强 赵天艺 张旭 张豫 孙志华 张辉 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期199-206,共8页
为了解新疆南疆地区绵羊体外寄生虫蜱蝇(Melophagus)的种类及其携带的病原,本研究于新疆南疆共采集582只蜱蝇,其中昆玉市一牧场54只、皮山农场180只,克州阿克陶县348只。通过形态学和蜱蝇18S rRNA基因的PCR扩增鉴定蜱蝇种类及性别。通过... 为了解新疆南疆地区绵羊体外寄生虫蜱蝇(Melophagus)的种类及其携带的病原,本研究于新疆南疆共采集582只蜱蝇,其中昆玉市一牧场54只、皮山农场180只,克州阿克陶县348只。通过形态学和蜱蝇18S rRNA基因的PCR扩增鉴定蜱蝇种类及性别。通过PCR检测蜱蝇中的巴尔通体(Bartonella)rpoB及gltA基因;杀雄菌(Arsenophonus)、无形体(Anaplasma)、埃立克体(Ehrlichia)、沃尔巴克体(Wolbachia)的16S rRNA基因;立克次体(Rickettsia)的Omp A、17 ku及16S r RNA基因并测序,根据测序结果统计羊蜱蝇对上述病原的携带率。将测序结果经BLAST比对,分析与上述测序基因相似性最高的病原。采用邻接法构建巴尔通体rpoB、gltA基因及杀雄菌与沃尔巴克体16S rRNA基因的系统发育树,分析羊蜱蝇携带上述3种病原的种类。统计羊蜱蝇病原的携带率,并分析不同性别及地区对羊蜱蝇携带病原的影响。形态学及PCR鉴定结果显示,本实验采集的蜱蝇均为羊蜱蝇,其中雌性350只,雄性232只。PCR结果显示,羊蜱蝇中巴尔通体、杀雄菌和沃尔巴克体均为阳性,埃立克体、嗜吞噬细胞无形体、斑点热群立克次体均为阴性。经统计羊蜱蝇巴尔通体、杀雄菌及沃尔巴克体的携带率分别为100%(582/582)、39.9%(232/582)及70.9%(413/582),且有34.4%(200/582)的羊蜱蝇同时携带上述3种病原。BLAST比对及上述基因的遗传进化分析结果显示,羊蜱蝇携带的巴尔通体均为Bartonella melophagi;携带的杀雄菌均为内共生杀雄菌;携带的沃尔巴克体均为内共生沃尔巴克体。经统计雌性羊蜱蝇对杀雄菌的携带率高于雄性,雄性羊蜱蝇沃尔巴克体的携带率高于雌性;采样地点经纬度不同对羊蜱蝇携带的病原种类基本无影响,但随海拔升高,羊蜱蝇对这3种菌的共同携带率越高,且内共生杀雄菌及内共生沃尔巴克体均对羊蜱蝇的生殖起调控作用,推测高海拔不利于羊蜱蝇的生存。本实验全面分析了新疆南疆地区羊蜱蝇的种类及携带的病原,为新疆地区羊蜱蝇的防治提供参考依据。 展开更多
关键词 体外寄生虫 羊蜱蝇 病原
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石河子市部分流浪犬源肠球菌耐药性及耐药基因检测
2
作者 曹兴旺 冯麟博 +5 位作者 李志远 杨子为 徐道元 杨吉奥博 关团 孙志华 《山东农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期236-249,共14页
为了解新疆石河子市部分流浪犬源肠球菌的耐药性以及耐药基因携带情况,本实验采集210份来自流浪犬粪便及其周边环境的样品。通过常规细菌分离鉴定法对肠球菌进行分离、纯化与鉴定,采用纸片扩散法测定分离株对14种抗菌药物的耐药性,利用... 为了解新疆石河子市部分流浪犬源肠球菌的耐药性以及耐药基因携带情况,本实验采集210份来自流浪犬粪便及其周边环境的样品。通过常规细菌分离鉴定法对肠球菌进行分离、纯化与鉴定,采用纸片扩散法测定分离株对14种抗菌药物的耐药性,利用PCR技术检测相关耐药基因携带情况。本实验共分离到163株肠球菌,其中119株来源于粪便,44株来源于环境。这些菌株包括23株粪肠球菌,129株屎肠球菌,11株其他肠球菌。药敏试验结果显示,流浪犬源肠球菌对磺胺异噁唑、克林霉素、利福平、泰妙菌素和庆大霉素表现出较高的耐药性,耐药菌株分别占100%、78.53%、67.48%、63.19%和53.37%;相比之下,对青霉素、氨苄西林、氟苯尼考的耐药率较低(2.45%~6.75%);值得注意的是,未检测出对万古霉素、替加环素、利奈唑胺耐药的菌株。多重耐药结果显示主要分布在4~6耐,占69.32%(113/163),其中6耐占比最高(25.15%),而1耐占比最低(1.23%)。此外,环境中肠球菌的耐药情况较粪便中肠球菌稍严重,且流浪犬源屎肠球菌的耐药情况也较粪肠球菌更为严重。耐药基因检测结果显示,检出erm(B)、aac(6′)/aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、tetM耐药基因,噁唑烷酮类药物相关耐药基因(optrA、cfr、poxtA)、万古霉素耐药基因(van)以及其他被检耐药基因均未检出。综上所述,流浪犬收容所很可能成为多重耐药菌的潜在储存库,存在相关耐药基因的流行风险。建议在治疗当地的宠物犬和流浪犬时,应根据细菌的耐药性结果来进行合理用药,并且加强对流浪犬细菌耐药性的监测,以减少耐药细菌传播的风险。 展开更多
关键词 流浪犬 肠球菌 粪肠球菌 屎肠球菌 耐药性
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布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究 被引量：4
3
作者 邱润辉 关飞虎 +7 位作者 王梓行 郭嘉 朱德馨 张伟 魏春燕 霍明凯 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1630-1640,共11页
【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合... 【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1800 V电压、400Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】试验成功获得片段大小为522、539、1054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BMCO基因缺失株 生长曲线 胞内生存
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TGF-β1在布鲁氏菌致炎过程中的作用及其与NLRP3炎症小体的相关性研究 被引量：3
4
作者 陶婷婷 赵天艺 +5 位作者 李佳 朱德馨 邱润辉 王梓行 孙志华 张辉 《动物医学进展》 北大核心 2022年第2期48-53,共6页
建立牛布鲁氏菌2308感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,用RT-qPCR检测感染细胞中TGF-β1在mRNA水平的变化;ELISA检测布鲁氏菌感染细胞后培养上清中TGF-β1、IL-1β和IL-18的释放量;Western blot分析TGF-β1蛋白水平的变化。布鲁氏菌侵染重... 建立牛布鲁氏菌2308感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,用RT-qPCR检测感染细胞中TGF-β1在mRNA水平的变化;ELISA检测布鲁氏菌感染细胞后培养上清中TGF-β1、IL-1β和IL-18的释放量;Western blot分析TGF-β1蛋白水平的变化。布鲁氏菌侵染重组外源TGF-β1(rTGF-β1)预孵育的巨噬细胞,检测TGF-β1对炎症因子IL-1β和IL-18的影响。构建布鲁氏菌感染小鼠模型,建模28 d后,将TGF-β1抗体以浓度为1μg/mL的剂量尾根静脉注射感染小鼠,分别在注射TGF-β1后第1天、第15天、第30天收集小鼠外周血,ELISA检测小鼠外周血血清中炎性因子IL-18和IL-1β分泌量。与对照组相比,在细菌侵染细胞前期TGF-β1在转录水平表达上调,而在进入细胞后表达下调,细胞上清中TGF-β1的含量显著升高(P<0.05),且在蛋白水平也出现差异性高表达。预孵育rTGF-β1后布鲁氏菌侵染的巨噬细胞中炎症因子IL-1β和IL-18释放量显著升高(P<0.05)。布鲁氏菌感染小鼠1周~4周后感染组小鼠血清中炎性因子TGF-β1的分泌量显著性低于对照组(P<0.05),在感染第2周后逐步上升。布鲁氏菌感染小鼠后各脏器有明显的病理变化,免疫组化结果显示TGF-β1在脾脏和肝脏中均有不同程度的表达。TGF-β1抗体的注射能够显著性降低布鲁氏菌感染鼠血清中IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05),布鲁氏菌感染过程中细胞因子TGF-β1分泌增加,外源性TGF-β1显著增加炎性IL-1β和IL-18的产生,而TGF-β1抗体注射布鲁氏菌感染小鼠可以缓解炎症反应。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 转化生长因子β1(TGF-β1) 炎症因子
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DDX1影响猪流行性腹泻病毒复制的机制研究
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作者 霍明凯 关飞虎 +4 位作者 邱润辉 魏春燕 于海涛 朱嘉乐 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1556-1566,共11页
【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:X... 【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:XM_021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX 1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋白的表达水平;使用生物信息学软件预测DDX1蛋白的磷酸化位点;免疫沉淀试验检测PEDV感染IPI-2I细胞12 h后DDX1的磷酸化水平。【结果】PCR成功扩增得到大小为2223 bp的DDX 1目的基因条带。双酶切鉴定结果显示,成功构建pMD19-T-DDX1克隆载体和pcDNA3.1-DDX1真核表达载体。与PBS组相比,转染pcDNA3.1-DDX1的细胞DDX1蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),表明DDX1转染成功。间接免疫荧光试验结果显示,与PBS组相比,PEDV感染组中出现大量绿色荧光信号,表明PEDV感染IPI-2I细胞模型构建成功;与PBS组相比,PEDV N蛋白的荧光信号明显减少,PEDV N基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析发现,DDX1蛋白具有多个磷酸化位点,其中包括17个丝氨酸、12个苏氨酸及6个酪氨酸。免疫沉淀试验结果显示,与未感染组相比,PEDV感染组中DDX1磷酸化水平极显著上升(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pcDNA3.1-DDX1真核表达载体,发现PEDV感染IPI-2I细胞12 h后,DDX1抑制了PEDV的复制,升高了磷酸化水平,说明DDX1在PEDV感染期间可能通过磷酸化抑制PEDV的复制。 展开更多
关键词 DDX1 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 磷酸化
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核桃叶精油提取工艺优化及其抑菌、抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性研究
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作者 戴君昂 张乐苒 +8 位作者 赵晶 邓兴梅 闫梦阳 韩馨馨 刘雪峰 赵天艺 张旭 孙志华 张辉 《中成药》 2025年第8期2703-2709,共7页
目的优化核桃叶精油提取工艺,并评价其抑菌、抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性。方法在单因素试验基础上,以料液比、超声时间、超声功率为影响因素,提取率为评价指标,Box-Behnken响应面法优化提取工艺,通过测定抑菌圈及最低抑菌浓度评价抑... 目的优化核桃叶精油提取工艺,并评价其抑菌、抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性。方法在单因素试验基础上,以料液比、超声时间、超声功率为影响因素,提取率为评价指标,Box-Behnken响应面法优化提取工艺,通过测定抑菌圈及最低抑菌浓度评价抑菌活性,测定DPPH、ABTS自由基清除能力评价抗氧化活性,MTT法测定对小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖的抑制活性,滤纸圈法、滤纸包法评价对图兰扇头蜱的驱杀能力。结果最佳条件为提取溶剂石油醚,料液比1∶20,超声时间30 min,超声功率200 W,提取率为0.077%。精油对粪肠球菌、链球菌、库特氏菌、金黄色葡萄球菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌有抑制作用,其中链球菌抑菌圈直径最大;对DPPH、ABTS自由基的IC_(50)值分别为0.532、0.344 mg/mL;对4T1细胞的IC_(50)值分别为115.3(24 h)、49.80(48 h)、24.00(96 h)μg/mL;对图兰扇头蜱的有效驱避时间为50 min,触杀LC_(50)值分别为4.5830(幼蜱)、22.442(若蜱)、45.441(成蜱)mg/mL。结论该方法稳定可靠,可用于提取抗氧化、抗肿瘤、驱杀蜱虫活性较强,抑菌活性较弱的核桃叶精油。 展开更多
关键词 核桃叶 精油 提取工艺 Box-Behnken响应面法 抑菌活性 抗氧化活性 抗肿瘤活性 驱杀蜱虫活性
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长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用 被引量：2
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作者 王梓行 邓兴梅 +6 位作者 邱润辉 朱德馨 李佳 陶婷婷 朱嘉乐 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1942-1950,共9页
【目的】试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】根... 【目的】试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1),利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M),并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型,在0、6、12、24、36和48 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达,以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3,分别转染Vero-E6细胞,待细胞汇合度达到90%时接毒,感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况,筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后,通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平,以验证自噬的发生情况。【结果】成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1,并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明,lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后,细胞皱缩、聚集成团,细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示,在1326 bp处出现目的条带,说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中,Western blotting结果显示,6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h(P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示,LC3的mRNA表达量在48 h最高,且极显著高于0 h(P<0.01),自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势,在48 h表达量最高,48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h(P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好,干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后,Western blotting结果显示,24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组,自噬受到抑制。【结论】PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生,lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 自噬 长链非编码RNA LC3蛋白
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布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的亚细胞定位及与宿主细胞互作蛋白的筛选 被引量：1
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作者 邱润辉 关飞虎 +6 位作者 陶婷婷 李佳 赵天艺 邓兴梅 史超 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第4期1438-1448,共11页
【目的】分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组... 【目的】分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组荧光定位载体,转染人胚肾上皮细胞293T,通过扫描激光共聚焦显微镜观察BPE005的细胞定位;构建PGBKT7-BPE005诱饵载体,验证诱饵载体是否有细胞毒性和自激活现象;以小鼠巨噬细胞RAW264.7 mRNA的cDNA文库为AD文库菌液,检测文库滴度,通过酵母双杂交系统筛选宿主细胞内与BPE005相互作用的靶蛋白。【结果】布鲁氏菌分泌蛋白BPE005属于疏水性蛋白,内含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链。成功构建PDRRED2-C1-BPE005荧光定位载体和PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体,BPE005定位于宿主细胞核。PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体无酵母细胞毒性和自激活现象,AD文库菌液滴度>2×10^(7)/mL,筛选出4个宿主细胞内与BPE0005存在相互作用的蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、补体因子H、鸟苷酸环化酶2G及颗粒蛋白。经复筛、测序、BLAST比对、一对一验证后,最终筛选出1个在宿主细胞内与BPE005具有较强相互作用的靶蛋白(RNA聚合酶Ⅱ多肽G)。对该蛋白的作用网络分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G对宿主细胞内mRNA的转录和合成具有重大影响。【结论】布鲁氏菌分泌蛋白BPE005定位于宿主细胞核,在宿主细胞内可与RNA聚合酶Ⅱ多肽G产生较强相互作用,对进一步阐明布鲁氏菌感染过程中关键效应分子的作用机制具有指导意义。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BPE005 亚细胞定位 酵母双杂交
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