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共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化
被引量:
2
1
作者
胡靖飞
尹人杰
+7 位作者
黄小波
刘志鹏
赵玉佳
曹三杰
文心田
文翼平
赵勤
伍锐
《四川农业大学学报》
CSCD
北大核心
2019年第4期542-549,578,共9页
【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩...
【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩增探针制备芯片阵列。重点改进了样品标记技术,引物直接标记与不对称PCR扩增结合,确定了不对称PCR扩增体系;并对点样缓冲液、水合时间、探针浓度、杂交时间和温度、清洗和干燥方式等条件进行优化。【结果】当博奥和百傲两种缓冲液比例为1∶1,水合时间为4 s,探针浓度为600 ng/μL,不对称PCR上下游引物比为1∶40,在48℃杂交3 h,用0.2%SDS清洗,1 000 r/min离心,该cDNA芯片效果最佳。【结论】本研究确定了PEDV-TGEV-GAR共检cDNA芯片的关键技术参数,为开展基因芯片的标准化制备和应用奠定了基础。
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关键词
猪腹泻病毒
CDNA芯片
直接标记法
不对称PCR
优化
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职称材料
猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
被引量:
3
2
作者
陈汭
付嘉钰
+10 位作者
刘浩宇
李成
赵玉佳
胡靖飞
瞿欢
曹三杰
文心田
文翼平
赵勤
伍锐
黄小波
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第8期104-110,共7页
旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Wester...
旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。
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关键词
猪δ冠状病毒
N蛋白
原核表达
多克隆抗体
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职称材料
题名
共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化
被引量:
2
1
作者
胡靖飞
尹人杰
黄小波
刘志鹏
赵玉佳
曹三杰
文心田
文翼平
赵勤
伍锐
机构
四川
农业
大学动物医学院猪病研究中心
农业部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站
四川
农业
大学国家级动物类
实验
教学示范中心
出处
《四川农业大学学报》
CSCD
北大核心
2019年第4期542-549,578,共9页
基金
国家重点研发计划(2016YFD0500700)
动物疫病共检测服务平台建设项目(D171100002117002)
文摘
【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩增探针制备芯片阵列。重点改进了样品标记技术,引物直接标记与不对称PCR扩增结合,确定了不对称PCR扩增体系;并对点样缓冲液、水合时间、探针浓度、杂交时间和温度、清洗和干燥方式等条件进行优化。【结果】当博奥和百傲两种缓冲液比例为1∶1,水合时间为4 s,探针浓度为600 ng/μL,不对称PCR上下游引物比为1∶40,在48℃杂交3 h,用0.2%SDS清洗,1 000 r/min离心,该cDNA芯片效果最佳。【结论】本研究确定了PEDV-TGEV-GAR共检cDNA芯片的关键技术参数,为开展基因芯片的标准化制备和应用奠定了基础。
关键词
猪腹泻病毒
CDNA芯片
直接标记法
不对称PCR
优化
Keywords
porcine diarrhea virus
cDNA microarray
direct fluorescent labeling
asymmetric PCR
optimization
分类号
Q939.94 [生物学—微生物学]
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职称材料
题名
猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
被引量:
3
2
作者
陈汭
付嘉钰
刘浩宇
李成
赵玉佳
胡靖飞
瞿欢
曹三杰
文心田
文翼平
赵勤
伍锐
黄小波
机构
四川
农业
大学动物医学院猪病研究中心
四川
农业
大学国家级动物类
实验
教学示范中心
农业部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第8期104-110,共7页
基金
国家重点研发计划-猪重要疫病的诊断与检测新技术研究(2016YFD0500700)
四川省科技计划资助(2020YFS0011)
+1 种基金
农业农村部农业重大技术协同推广计划试点项目
动物疫病共检测服务平台建设(D171100002117002)。
文摘
旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。
关键词
猪δ冠状病毒
N蛋白
原核表达
多克隆抗体
Keywords
porcine deltacoronavirus
N protein
prokaryotic expression
polyclonal antibody
分类号
S852.651 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化
胡靖飞
尹人杰
黄小波
刘志鹏
赵玉佳
曹三杰
文心田
文翼平
赵勤
伍锐
《四川农业大学学报》
CSCD
北大核心
2019
2
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
陈汭
付嘉钰
刘浩宇
李成
赵玉佳
胡靖飞
瞿欢
曹三杰
文心田
文翼平
赵勤
伍锐
黄小波
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2020
3
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