猪IL-1β单克隆抗体制备及其抗炎症反应活性 被引量：1

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作者 李璠 孙海凤 +5 位作者 孙萌 高雁怩 孙杨杨 张路捷 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期890-899,共10页

IL-1β可介导炎症病理,阻断IL-1活性具有重要抗炎治疗作用。本研究通过构建猪IL-1β原核表达质粒,进行大肠杆菌表达和蛋白纯化,制备重组蛋白。采用细胞杂交瘤技术制备获得4株稳定分泌IL-1β单克隆抗体杂交瘤细胞株(1E2、2H3、5H3及7E7);... IL-1β可介导炎症病理,阻断IL-1活性具有重要抗炎治疗作用。本研究通过构建猪IL-1β原核表达质粒,进行大肠杆菌表达和蛋白纯化,制备重组蛋白。采用细胞杂交瘤技术制备获得4株稳定分泌IL-1β单克隆抗体杂交瘤细胞株(1E2、2H3、5H3及7E7);4株单抗腹水ELISA效价高达1∶1024000;5H3单抗识别的抗原表位为149 DLKREVVFCM 158;1E2、2H3和7E7单抗所识别的抗原表位为202 KRYPKRD 208。脂多糖(LPS)小鼠炎症模型抗炎试验结果显示,相对LPS对照组,IL-1β单抗处理组小鼠血清NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量及临床症状评分显著降低,表明4株单抗均有较好抗炎效果,其中1E2单抗抗炎作用最优,为猪IL-1β阻断药物研究奠定了重要基础。 展开更多

关键词 IL-1Β 单克隆抗体 炎症治疗

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副结核分枝杆菌三重TaqMan qPCR检测方法的建立

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作者 刘添 吴雨伦 +1 位作者 姚火春 潘子豪 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第9期4750-4758,共9页

副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)是造成反刍动物约翰病的病原,每年给全球畜牧业带来难以估计的经济损失。由于治疗困难,目前对患畜的及时诊断和尽早淘汰是副结核防控的主要手段。MAP的金标准培养检测... 副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)是造成反刍动物约翰病的病原,每年给全球畜牧业带来难以估计的经济损失。由于治疗困难,目前对患畜的及时诊断和尽早淘汰是副结核防控的主要手段。MAP的金标准培养检测周期长,而qPCR技术直接检测样本核酸能够快速确定病原,目前广泛应用。本研究旨在针对MAP非插入序列(insertion sequence,IS)靶标建立一种检测MAP的三重TaqMan qPCR方法,能够提高检测的敏感性和特异性。针对MAP基因组中MAP2765c、F57和hspX基因设计引物探针;以本实验室分离的MAP菌株为对照,建立三重qPCR检测体系;临床采集奶肉牛样品181份,和国标(GB/T 27637—2011)进行符合性试验。结果显示,本研究建立的三重qPCR方法灵敏度能达到10 copies·μL^(-1);重复结果变异系数均小于5%;特异性试验中仅MAP核酸出现扩增曲线;标准曲线R2均大于0.999且扩增效率为97%~100%;三重qPCR方法检测临床样品的阳性率为22.65%(41/181),比国标方法高(15.47%),两种方法的检测符合率为76.28%(138/181);根据牧场检测需求对样品进行分类分析:国标方法和三重qPCR方法在“高MAP风险样品”的样品中检出率分别为25%(17/68)和44.12%(30/68),而两种方法检测较低MAP风险样品的阳性率均为9.73%(11/113)。本研究设计的三重qPCR方法,灵敏度、特异性和重复性良好,线性和定量准确性高,且能比国标方法更灵敏地在高MAP风险样品中检出MAP。研究结果为奶牛和肉牛养殖场开展副结核病的监测、预警、控制和净化提供优选方案。 展开更多

关键词 约翰病 副结核分枝杆菌 qPCR 三重TaqMan

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纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响 被引量：1

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作者 李鑫椿 王硕玥 吴宗福 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期923-931,共9页

[目的]本研究旨在明确纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[方法]以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考,同源性比对分析猪源巴氏链球菌WUSP067中纤维二糖利用基因簇,通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株... [目的]本研究旨在明确纤维二糖利用基因簇对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[方法]以肺炎链球菌基因组中纤维二糖利用基因簇为参考,同源性比对分析猪源巴氏链球菌WUSP067中纤维二糖利用基因簇,通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、RT-PCR、缺失株构建、不同条件下的生长曲线测定、小鼠毒力试验等评价其对巴氏链球菌生长及毒力的影响。[结果]巴氏链球菌WUSP067基因组中存在2个潜在的纤维二糖利用相关基因簇(cellobiose locus, CL),将其分别命名为CL1和CL2,它们均包括编码磷酸转移酶系统和β-葡萄糖苷酶的基因。RT-qPCR结果显示,与添加10 g·L^(-1)葡萄糖的DMEM培养基相比,在添加10 g·L^(-1)纤维二糖的DMEM培养基中,CL1中的BglP1_(wp)和BglA_(wp)基因表达量无显著差异,而CL2中celA_(wp)和celB_(wp)基因表达极显著上调(P<0.000 1),分别上调49倍和33倍,提示其参与利用纤维二糖。选择CL2深入研究,RT-PCR结果显示,该基因簇由2个操纵子组成。构建编码β-葡萄糖苷酶的celA_(wp)基因缺失株,生长曲线分析表明,野生株和celA_(wp)基因缺失(ΔcelA_(wp))株在THB、DMEM+10 g·L^(-1)葡萄糖条件下生长情况无明显差异,但在DMEM+10 g·L^(-1)纤维二糖条件下,野生株能以纤维二糖为唯一碳源生长,而ΔcelA_(wp)表现出明显的生长缺陷,生长12 h时D_(600)仍低于0.5。以断奶仔鼠为感染模型,比较野生株和ΔcelA_(wp)株的毒力,每鼠攻毒剂量为3×10^(8) CFU,野生株攻毒组小鼠3日内全部死亡,而ΔcelA株攻毒组的小鼠死亡趋势较缓,14 d后存活率为20%(P<0.05)。[结论]猪源巴氏链球菌WUSP067能以纤维二糖为唯一碳源生长,CL2是纤维二糖利用相关基因簇,其中celA_(wp)基因不仅促进该菌利用纤维二糖,而且还影响该菌的毒力,在巴氏链球菌致病过程中发挥作用。 展开更多

关键词 巴氏链球菌 纤维二糖 生长 毒力

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扬子鳄源普通变形杆菌FliL基因缺失株的构建及其特性分析 被引量：1

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作者 李林俐 朱来旭 +1 位作者 张雪 费荣梅 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期729-735,共7页

[目的]本文旨在研究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌(Proteus vulgaris from Alligator sinensis)生物学特性的影响。[方法]在扬子鳄源普通变形杆菌野生株XX2的基础上利用Red重组系统构建FliL基因缺失株和互补株。通过对野生株、FliL基... [目的]本文旨在研究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌(Proteus vulgaris from Alligator sinensis)生物学特性的影响。[方法]在扬子鳄源普通变形杆菌野生株XX2的基础上利用Red重组系统构建FliL基因缺失株和互补株。通过对野生株、FliL基因缺失株和互补株的生长曲线分析,探究FliL基因缺失对扬子鳄源普通变形杆菌生物学特性的影响;利用细菌具有周期性群集运动特性,通过分析FliL基因缺失株与野生株在固体LB培养基和Mot半固体培养基上的迁移运动,探究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌运动的影响;通过小鼠致病性试验,探究FliL基因对细菌毒力的影响。[结果]细菌接种后5 h内FliL基因缺失株与野生株生长速度基本无差别,5 h后其生长速度慢于野生株;细菌群集运动和细菌动力试验显示,FliL基因缺失株群集运动明显减弱,但仍可在Mot半固体琼脂培养基上正常进行迁移运动;小鼠致病性试验显示,野生株XX2的LD_(50)为2.3×10^(6) CFU·mL^(-1),FliL基因缺失株XX2ΔFliL的LD_(50)为4.9×10^(8) CFU·mL^(-1),FliL基因缺失株LD_(50)升高了约100倍。[结论]FliL基因缺失可显著降低扬子鳄源普通变形杆菌的群集运动和细菌毒力,将为进一步研究扬子鳄源普通变形杆菌介导的扬子鳄痛风等疾病奠定基础。 展开更多

关键词 普通变形杆菌 扬子鳄 FliL基因 毒力

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副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

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作者 陈敏 刘明星 +2 位作者 张鹏云 蔺辉星 范红结 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期304-316,共13页

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,... 旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100~200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100~200 nm处的粒子数目最多。进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在。用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)36 h,检测STEC中cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性。结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低。而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加。另外,用免疫磁珠捕获的方法去除OMVs中的CdtB(OMVs-ΔCdtB),OMVs-ΔCdtB处理STEC 36 h后cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异。综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路。 展开更多

关键词 副猪格拉瑟菌 外膜囊泡 细胞致死性膨胀毒素CdtB 猪呼吸道上皮细胞

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兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用 被引量：6

6

作者 王冠萱 陈萌萌 +8 位作者 仇汝龙 范志宇 胡波 宋艳华 魏后军 葛雷 徐为中 王芳 钱莺娟 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第18期40-44,共5页

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血... 兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR。结果显示,稀释度为1×10^(8)~1×10^(4) copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r^(2)为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为100~1000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%~1.61%之间。用该方法对60份临床肝脏样品和52份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%)。因此,该方法能够同时检测RHDV1型和RHDV2型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒。 展开更多

关键词 兔出血症病毒1型 兔出血症病毒2型 双重TaqMan qPCR

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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定 被引量：2

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作者 袁丽 孙杨杨 +4 位作者 张路捷 张杰 孙海凤 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3424-3434,共11页

旨在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白单克隆抗体及解析其抗原表位。本研究构建了PRRSV类NADC30毒株FJ1402的GP3大肠杆菌表达质粒,制备获得重组GP3蛋白。经过免疫BALB/c小鼠和间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。利用间接... 旨在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白单克隆抗体及解析其抗原表位。本研究构建了PRRSV类NADC30毒株FJ1402的GP3大肠杆菌表达质粒,制备获得重组GP3蛋白。经过免疫BALB/c小鼠和间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。利用间接免疫荧光试验和蛋白印迹鉴定单克隆抗体特异性。通过构建GP3蛋白基因截短体和合成多肽ELISA鉴定单克隆抗体识别的表位区域。结果显示,成功筛选了7株稳定分泌GP3蛋白抗体的杂交瘤细胞株,7株单克隆抗体均可与PRRSV FJ1402产生特异性反应。鉴定出GP3蛋白4个抗原表位,分别为^(55)PLCPTRQAAAEILE^(68)、^(69)PGKSFWCRI^(77)、^(78)GHDRCSESDH^(87)和^(88)DELGFMVPPGLSS^(100)。2E12单抗与FJ1402、BB0907和S1三个谱系毒株均可发生IFA和Western blot特异反应,4H9、9F3和6B3单抗只与FJ1402毒株反应,而不与BB0907和S1毒株反应。本研究研制成功7株GP3蛋白单克隆抗体,并鉴定出4个GP3蛋白抗原表位,为PRRSV检测和GP3蛋白功能研究提供了重要工具。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP3蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立 被引量：3

8

作者 张路捷 高雁怩 +2 位作者 夏婷婷 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1509-1516,共8页

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测11... 本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准:当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA

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2017年华东六省猪伪狂犬病感染抗体检测 被引量：1

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作者 张盼盼 张日腾 +3 位作者 范慧 李仕海 姜平 白娟 《中国动物检疫》 CAS 2018年第9期9-12,共4页

为了解华东六省猪伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,对2017年华东地区6个省份310家猪场送检的10 179份猪血清样品,应用PRV gE-ELISA抗体检测试剂盒进行感染抗体检测。结果显示:248家猪场被检出PRV gE阳性抗体,场群阳性率为80.00%(248/310);4 ... 为了解华东六省猪伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,对2017年华东地区6个省份310家猪场送检的10 179份猪血清样品,应用PRV gE-ELISA抗体检测试剂盒进行感染抗体检测。结果显示:248家猪场被检出PRV gE阳性抗体,场群阳性率为80.00%(248/310);4 546份血清样本被检出PRV gE抗体阳性,样本阳性率为44.66%(4 546/10 179)。对不同季节和不同饲养阶段样品的PRV gE抗体阳性率进行统计发现:春季样品阳性率最高,冬季偏低;种母猪样本阳性率最高,为60.59%,其次是经产母猪,种公猪最低。结果表明,华东六省猪群PRV野毒感染较为严重,尤其是母猪群。因此,这些省份应加大猪伪狂犬病的综合防控力度,重点关注种母猪群。 展开更多

关键词 猪伪狂犬病 gE抗体 流行病学调查 华东六省

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一例PEDV S-INDEL重组毒案例的复盘分析

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作者 张欣 崔敏 +3 位作者 杨雷 王云龙 刘海成 姜平 《今日养猪业》 2023年第1期77-80,共4页

山东省烟台市某规模化猪场哺乳仔猪发生以水样腹泻为主要症状的临床案例,采集腹泻病料,荧光定量PCR检测流行性腹泻抗原阳性,阳性样品进行测序分析,遗传进化分析位于新型PEDV毒株中的G1b亚型,首次发现PEDV S-INDEL重组毒。通过紧急防控措... 山东省烟台市某规模化猪场哺乳仔猪发生以水样腹泻为主要症状的临床案例,采集腹泻病料,荧光定量PCR检测流行性腹泻抗原阳性,阳性样品进行测序分析,遗传进化分析位于新型PEDV毒株中的G1b亚型,首次发现PEDV S-INDEL重组毒。通过紧急防控措施,疫情未发生扩散,通过复盘分析,确定此次疫情来源于引种所致。 展开更多

关键词 流行性腹泻 水样腹泻 PEDV 腹泻病 测序分析 哺乳仔猪 规模化猪场 荧光定量PCR检测

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猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

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作者 张宝戈 黄雅琴 +2 位作者 蔡金双 朱晨光 李玉峰 《畜牧兽医学报》 CAS 2024年第3期1170-1178,共9页

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆... 旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。 展开更多

关键词 猪圆环病毒3型 Cap重组蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA

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